Avaliação do efeito de antimaláricos in vitro utilizando parasitas transgênicos

Resumo

A malária é responsável por mais de 200 milhões de casos e de 400 mil mortes por ano mundialmente. Cinco espécies de Plasmodium causam infecções humanas: Plasmodium falciparum, P. vivax, P. ovale, P. malariae e P. knowlesi. P. falciparum é responsável pela forma mais letal da doença e recebe a maior parte dos investimentos em pesquisa, principalmente pela existência de técnicas de cultivo in vitro. Entretanto, P. falciparum é distante evolutiva e biologicamente de outras espécies, e medidas de controle desenvolvidas não apresentem a mesma eficiência quando aplicadas contra as outras quatro espécies. O desenvolvimento de novas drogas antimaláricas é necessário, pois os parasitas desenvolvem mecanismos de resistência constantemente. Antimaláricos possuem ação estágio-específica, existindo apenas uma droga (Primaquina) capaz de eliminar as formas hepáticas. Além disso, a ação de compostos pode variar entre as espécies. Atualmente a avaliação de novos compostos é feita in vitro, utilizando P. falciparum e a técnica de SYBR Green, que consiste do uso de uma molécula fluorescente (SYBR), que se intercala na dupla fita de DNA. A multiplicação do DNA/crescimento dos parasitas pode ser quantificado após a detecção da fluorescência liberada após a adição de SYBR Green aos lisados celulares. De maneira similar é possível utilizar parasitas transgênicos bioluminescentes para avaliar o efeito de drogas. A luz liberada pela reação enzimática de um gene repórter luciferase produzido pelos parasitas e seu substrato pode ser quantificada, indicando a quantidade de parasitas na cultura. A reação de bioluminescência pode ser mais sensível que a reação de SYBR, detectando um número menor de parasitas, permitindo ensaios em formato menor e consequentemente o teste de um número maior de compostos simultaneamente. Recentemente, linhagens de P. knowlesi (espécie evolutivamente próxima de P. vivax, P. malariae e P. ovale) foram adaptadas a cultura in vitro, oferecendo uma alternativa para a pesquisa de malária. O projeto pretende padronizar as técnicas de SYBR Green e bioluminescência para ensaios de ação de drogas contra P. knowlesi in vitro. O projeto prevê a padronização de ensaios de ação de drogas em placas de cultura de 96 e 384 poços, utilizando o aparelho GloMax Explorer (Promega), capaz de ler fluorescência e luminescência. Para esta padronização serão utilizados 6 compostos de efeito conhecido em P. falciparum: cloroquina, blasticidina, G418, pirimetamina, WR99210 e metotrexato. Durante a padronização vamos testar as variáveis hematócrito, volume de cultura, parasitemia inicial, tempo de crescimento, e também protocolos de lise de parasitas e concentração de SYBR Green do substrato de luciferase. Após a padronização, os ensaios poderão ser utilizados para a avaliação de novos compostos antimaláricos e permitirá a comparação de resultados obtidos em P. falciparum e P. knowlesi.