Análise Filogenômica de Cladochytriales (Chytridiomycota): uma nova abordagem para os fungos zoospóricos

Resumo

Os organismos incluídos no filo Chytridiomycota existem na Terra há pelo menos 400 milhões de anos, como apontado por dados de registros fósseis. Apresentam distribuição cosmopolita e papel crucial nos processos de decomposição e parasitismo que ocorrem nos ecossistemas aquáticos e terrestres, onde são frequentemente observados como parasitas de algas, cianobactérias, macrófitas, invertebrados, anfíbios, fungos e oomicetos. A classificação e as relações filogenéticas dos representantes deste filo vêm passando por profundas reestruturações devido a disponibilização de dados de sequências gênicas e investigação das diferenças na ultraestrutura dos zoósporos. Atualmente o filo Chytridiomycota conta com nove ordens, com Rhizophydiales, Chytridiales e Cladochytriales representando as mais expressivas em número de espécies. As duas primeiras foram intensamente estudadas nos últimos anos com relação à filogenia de genes ribossomais, sistemática e dados de ultraestrutura dos zoósporos, para as quais foram propostas novas famílias, gêneros e espécies. Cladochytriales, por outro lado, tem sido pouco estudada filogeneticamente e esparsas modificações foram realizadas desde a sua proposição. Uma nova abordagem tem sido empregada para o estudo das relações filogenéticas no reino Fungi, a qual tem se baseado em dados genômicos. Diferentemente dos representantes de Ascomycota, Basidiomycota e Zygomycota sensu Moreau, para os quais dados genômicos tem transformado nossa compreensão das relações filogenéticas e processos evolutivos, esta abordagem ainda não foi realizada para os de Chytridiomycota de uma forma mais ampla. Considerando o exposto, propõe-se neste projeto de pesquisa sequenciar o genoma completo de representantes de Cladochytriales, objetivando responder as hipóteses propostas. Além disso, o mesmo representa uma abordagem inédita de sequenciamento do genoma de representantes desta ordem, ampliando a informação sobre dados genômicos para o filo, os quais ainda são escassos. Para isso, 26 táxons depositados nas coleções de cultura da Universidade de Michigan, Universidade do Alabama e Instituto de Botânica foram selecionados para sequenciamento do genoma completo por representarem as espécies tipos dos gêneros incluídos na ordem, apresentarem ampla distribuição geográfica e/ou posicionamento filogenético indefinido. Buscando ampliar a disponibilidade de táxons que potencialmente poderiam ser incluídos neste estudo, realizaremos mensalmente (durante os 6 primeiros meses) coletas de amostras de água e solo no Parque Estadual das Fontes do Ipiranga (PEFI) e Reserva Biológica de Paranapiacaba, com o objetivo de isolar representantes de Cladochytriales ainda não incluídos em quaisquer filogenias. Culturas das espécies alvo (mencionadas acima), bem como as espécies que potencialmente serão isoladas nas respectivas áreas de estudo, serão reativadas e inoculadas em meios de cultura sólido para a extração do DNA genômico. Após esse procedimento, reações de amplificação de deslocamento múltiplo (MDA) serão preparadas com "MDA master mix" e as bem-sucedidas serão diluídas para controle de qualidade e pureza por análise de PCR. Após a confirmação da espécie alvo, cada reação MDA será preparada como uma biblioteca separada através do kit "Nextera XT Library Prep". As bibliotecas independentes serão sequenciadas no Joint Genome Institute (JGI) e montadas em SPAdes 3.10.0. Como os conjuntos provavelmente serão metagenomas, usaremos três critérios de abordagem para a categorização das sequências, com o intuito de separar o genoma alvo de possíveis contaminações. As árvores de genes serão inferidas no RAxML 8.2.8, as quais serão rastreadas manualmente a procura de regiões parálogas, bem como possíveis contaminações. Os marcadores serão concatenados usando "scripts" personalizados e a árvore final será inferida com RAxML 8.2.8. Por fim, uma árvore consenso será construída com ASTRAL 5.6.1, utilizando as árvores individuais de genes.