Reconstrução ancestral da beta-manosidase GH5_18 de Bifidobacterium longum

Resumo

A família 5 das hidrolases glicosídicas (GH5) consiste em mais de 12.000 membros que reconhecem e hidrolisam uma ampla gama de carboidratos. Para uma melhor compreensão da grande diversidade do seu repertório enzimático, Asperborg et al. (2012) classificaram a família GH5 em 51 subfamílias, das quais 20 não possuíam dados de caracterização disponíveis até o momento. No atual projeto de doutorado FAPESP 2016/00740-2, um dos objetivos é fornecer os primeiros dados estruturais e funcionais para a subfamília GH5_18 não caracterizada. Utilizando ensaios enzimáticos, descobrimos que um dos membros GH5_18, a enzima que denominamos BlMan5B, é uma ²-manosidase altamente específica para a clivagem do dissacarídeo 2-Acetamido-2-desoxi-4-O-(bD-manopiranosil)-D-glucopiranose (Man-²1,4-GlcNAc), um produto intermediário da decomposição de N-glicanos. A estrutura tridimensional de BlMan5B foi determinada por cristalografia de raios X e o modelo gerado revelou características estruturais únicas no universo CAZyme: uma região C-terminal flexível que é estabilizada na presença de N-acetilglicosamina (GlcNAc), atuando como um tampa no sítio ativo; um domínio de Rossmann que parece ser importante para a regulação do C-terminal flexível; e um arranjo dimérico estabilizado por uma troca do resíduo Trp120 entre as subunidades do dímero (triptofano swapping), resíduo o qual também interage com o substrato. O BlMan5B é a primeira enzima GH5 descria que atua na decomposição de N-glicanos e sua atividade sem precedentes reflete suas características estruturais únicas. A filogenia da subfamília GH5_18 sugere que essa especialização ocorreu ao longo da conquista do microambiente intestinal. Para entender melhor a evolução dessa enzima e como ela se correlaciona com a adaptação ao intestino humano, a técnica de reconstrução de sequências ancestrais pode ser uma ferramenta poderosa. Usando essa abordagem, podemos ressuscitar enzimas em diferentes estágios evolutivos, resgatando características enzimáticas ancestrais em diferentes períodos geológicos. Além de mostrar gradualmente a aparência do reconhecimento de GlcNAc pelas beta-manosidases GH5_18, a técnica de reconstrução ancestral geralmente resulta em enzimas mais eficientes, termoestáveis e generalistas que podem ser usadas em vários processos industriais e biotecnológicos. Portanto, durante o período no laboratório do Prof. Jimenez, pretendemos reconstruir as sequências ancestrais do BlMan5B para entender como o reconhecimento específico de GlcNAc emergiu ao longo de sua história evolutiva e para avaliar o potencial biotecnológico de seus ancestrais.