Padronização da extração de miRNA circulantes do plasma de pacientes com Hipercolesterolemia Familial

Resumo

A epigenética é o estudo das modificações reversíveis e herdadas durante a divisão celular que podem mudar a atividade biológica final de uma proteína sem alterar a sequência gênica. Entre os principais mecanismos epigenéticos estão os microRNA (miRNA), os quais atuam no controle da expressão gênica, inibindo a tradução ou levando à degradação do RNA mensageiro. A expressão alterada de alguns miRNA já foi fortemente associada com as doenças cardiovasculares e doenças metabólicas, incluindo as dislipidemias. Contudo, a elucidação do papel dos miRNA no desenvolvimento dessas doenças podem contribuir para a descoberta de novos biomarcadores, assim como, de possíveis alvos para o desenvolvimento de novos de fármacos. Os miRNA têm sido identificados como moléculas chave na regulação de proteínas envolvidas na homeostase do colesterol, como por exemplo, as proteínas codificadas pelos genes SREBP1, SREBP2, ABCA1, LDLR, HMGCR e APOA1. Porém, muitos estudos ainda precisam ser realizados para esclarecer a influência dos miRNA na fisiopatologia da Hipercolesterolemia Familial (HF). Por essa razão, o presente plano de trabalho tem como objetivo padronizar a extração de miRNA circulantes do plasma de indivíduos com HF, para que os mesmos possam ser utilizados em outras etapas do projeto temático ao qual essa bolsa está vinculada. Para isso, o plasma dos pacientes será obtido a partir de amostras de sangue total coletado em tubo contendo anticoagulante EDTA e a extração dos miRNA do plasma será realizada utilizando o kit miRNeasy Serum/Plasma (Qiagen). Inicialmente o protocolo será conduzido de acordo com as recomendações do fabricante. Em seguida, serão avaliados diferentes inputs (volume de plasma) e realizadas adaptações à técnica para otimização do protocolo de acordo com o rendimento obtido. O rendimento será avaliado utilizando um controle exógeno (mir-39) durante a extração e avaliando sua expressão por PCR quantitativa em Tempo Real. Os miRNA extraídos serão mantidos em freezer -80ºC até o momento do uso.