Análise Proteômica de Vesículas Extracelulares Isoladas de Saliva e Plasma de Pacientes com Carcinoma de Células Escamosas para Estudo de Modificações Pós-Traducionais e Proposição de Marcadores Clínicos

Resumo

O carcinoma de células escamosas (CEC) é uma neoplasia maligna derivada do epitélio escamoso estratificado e corresponde ao tipo mais comum de câncer de oral. No Brasil, estima-se a ocorrência de cerca de 600 mil novos casos de câncer em 2018, dentre os quais 14.700 seriam afecções da cavidade oral. O fator prognóstico mais utilizado é o estadiamento clínico do tumor, baseando-se na classificação TNM (tumor - T, linfonodos - N e metástases - M). Entretanto, esse sistema de classificação assume que tumores com morfologia e estágio similares apresentam o mesmo comportamento, enquanto sabe-se que aspectos moleculares sutis podem ter grande impacto no desenvolvimento tumoral. Como exemplo, as secreções por vesículas extracelulares (VEs) tem sido fortemente associadas à um novo modo de comunicação intercelular atuando como carreadoras de moléculas sinalizadoras envolvidas na reprogramação de células adjacentes até preparação do sítio pré-metastático. No entanto, o conhecimento sobre a composição e a forma com que as VEs atuam na progressão tumoral é limitado. Trabalhos desenvolvidos por este grupo, somados à dados da literatura, antecipam que o proteoma das VEs é complexo e propenso à modificações pós-traducionais (PTMs), como fosforilação, ubiquitinação e degradação proteolítica. Logo, se faz necessário a aplicação de uma metodologia robusta para caracterização molecular das VEs permitindo a melhor compreensão do seu papel fisiológico. Dessa forma, este projeto propõe a utilização da proteômica quantitativa baseada em espectrometria de massas para caracterização de proteínas e peptídeos endógenos de VEs de saliva e plasma de pacientes (a) sem CEC oral, (b) lesões pré-malignas, (c) CEC pré-cirúrgico e (d) CEC pós-cirúrgico. Metodologias para enriquecimento e identificação de espécies fosforiladas e ubiquitinadas serão utilizadas buscando o melhor entendimento do papel dessas PTMs em VEs isoladas de pacientes com CEC. Por meio da interpretação de espectros de massas independente de bancos de sequências (de novo) investigaremos a ocorrência de splicing alternativo, polimorfismos e mutações. Ainda, análises de bioinformática serão utilizadas no estudo de processos celulares regulados, predição das proteases envolvidas na geração dos peptídeos endógenos, entre outras predições estruturais e funcionais. Além disso, marcadores de interesse clínico serão propostos e verificados por análise targeted com metodologia otimizada para maior sensibilidade, seletividade e throughput. A partir dos resultados gerados espera-se, (i) obter-se um repertório de proteínas e peptídeos endógenos de VEs isoladas de saliva e plasma, (ii) ampliar o conhecimento sobre o papel de PTMs e sequências alternativas em VEs, (iii) associar essas informações às características clínico-patológicas dos pacientes e (iv) desenvolver uma metodologia de análise proteômica targeted de marcadores clínicos do CEC oral.