O papel antioxidante da melatonina em complexos cumulus-oócito e embriões produzidos in vitro

Resumo

A melatonina (MLT) é uma indolamina que pode atuar na sazonalidade reprodutiva em algumas espécies, ter atividade antioxidante e antiapoptótica, assim como influenciar diferentes vias de sinalização celular. Estudos in vitro têm apontado efeitos benéficos do uso da MLT na maturação (IVM) e cultivo in vitro (CIV) de oócitos e embriões bovinos, respectivamente. Neste estudo, propomos investigar os efeitos da MLT durante a MIV na maturação oocitária e durante o CIV no desenvolvimento e qualidade do embrião. Os efeitos da função antioxidante e mitocondrial em oócitos e embriões também serão avaliados. No experimento 1, complexos cumulus-oócito (CCOs) serão cultivados por 24 h para MIV com MLT e/ou associações com gonadotrofinas: 1) CN (controle negativo; sem gonadotrofinas); 2) FSH; 3) FSH+MLT; 4) FSH+LH e 5) FSH+LH+MLT. Os oócitos serão avaliados quanto à taxa de maturação (metáfase II - MII), Potencial de Membrana Mitocondrial (MMP), concentração de ATP, níveis de espécies reativas de oxigênio (EROs) e número de cópias do DNA mitocondrial (mtDNA). A melhor combinação de MLT e gonadotrofinas será utilizada no experimento 2, no qual CCOs maturados serão submetidos à fertilização in vitro (FIV), seguida de CIV com MLT (0, 10-11, 10-9 e 10-7M). Os embriões serão avaliados quanto à taxa de clivagem, desenvolvimento e qualidade do blastocisto (ICM/TE), número de cópias do mtDNA e abundância de transcritos para genes relacionados ao estresse oxidativo (TXNRD1, GLRX2); Via NRF2 (NFR2 e GCLM); via glutationa (GSTT1 e GCLC) e marcadores de qualidade embrionária (OCT4, BMP15, PLAC8, GLUT1). No terceiro experimento, CCOs serão maturados in vitro em três tratamentos: sem antioxidante (controle), MLT ou com um antioxidante mitocondrial (mtAOx). Após 24 h de MIV, os oócitos serão avaliados quanto à MII, MMP, ATP, ROS e mtDNA. No experimento 4, o CIV incluirá três tratamentos: sem antioxidante, MLT ou mtAOx. Os embriões serão avaliados quanto à taxa de clivagem, desenvolvimento e qualidade dos blastocistos (ICM/TE), mtDNA e abundância de transcritos para os mesmos genes utilizados no experimento 2. No experimento 5, os tratamentos que obtiveram as melhores taxas de MIV e CIV nos experimentos 4 e 5, respectivamente, serão utilizados. Serão testados quatro tratamentos: controle (sem antioxidante durante a MIV e CIV), melhor MIV e sem antioxidante no CIV, sem antioxidante na MIV e melhor antioxidante no CIV e, melhor MIV e melhor antioxidante de CIV. Os embriões serão avaliados quanto à taxa de clivagem, desenvolvimento e qualidade do blastocisto (ICM/TE), mtDNA, fragmentação nuclear (TUNEL), abundância de transcritos como no experimento 2 e criotolerância à vitrificação. (AU)