Análise do perfil metabólico pré e pós-deleção do gene histona deacetilase no fungo Penicillium brasilianum

Resumo

O fungo Penicillium brasilianum, isolado como endofítico de Melia azedarach, apresenta um grande potencial de produção de metabólitos secundários bioativos conforme verificado em análises funcionais do genoma deste microorganismo. O fungo Penicillium brasilianum teve seu genoma recentemente sequenciado e o assembly final revelou 252 supercontigs os quais foram submetidos a predições gênicas e anotação automática. As análises funcionais do genoma revelaram 69 possíveis clusteres biossintéticos, sendo 11 relacionados a biossíntese de potenciais compostos policetídicos via enzimas do tipo PKS (policetídeos sintase); 12 diferentes clusteres envolvidos na produção de metabólitos secundários formados via enzimas do tipo NRPS (peptídeo não-ribossomal sintetases) e 6 clusteres biossintéticos híbridos, entre eles o híbrido NRPS-terpeno responsável pela biossíntese de alcalóides, indicando o grande potencial deste organismo em produzir metabólitos secundários bioativos. Os genes que codificam a produção destes metabólitos encontram-se em clusteres, ou seja, agrupamentos de genes biossintéticos que participam de uma mesma via metabólica. Entretanto, a partir de condições padrão de cultivo em laboratório, muitas vezes não conseguimos acesso a estes produtos naturais, sendo que a maioria destes clusteres biossintéticos encontram-se silenciados. Uma das abordagens utilizadas para promover a ativação destes clusteres gênicos é a alteração da configuração da cromatina, uma vez que ela é um importante regulador da expressão gênica em eucariotos. A deleção do gene HdaA, responsável pela codificação das enzimas histona deacetilase, aumenta a disponibilidade da fita de DNA para a transcrição, podendo ativar clusteres gênicos previamente silenciados. Neste projeto, objetivamos a deleção do gene HdaA do fungo P. brasilianum, como uma estratégia para ativação da produção de metabólitos secundários e desta forma, promover diversidade de produtos naturais. A deleção será conduzida a partir da construção de um cassete de deleção para o gene HdaA utilizando sistema de recombinação homóloga in vivo em S. cerevisiae. O material será purificado e usado nas reações de transformação da linhagem selvagem para a produção dos mutantes. Após a confirmação do mutante obtido a partir de técnicas moleculares, será realizada a comparação do perfil metabólico do fungo selvagem e do mutante por técnicas de LC-MS-MS e posteriormente caracterização de possíveis metabólitos induzidos por RMN 1D e 2D.