Expressão, purificação e caracterização inicial de uma nova proteína RPA-like de Trypanosoma brucei

Resumo

Protozoários parasitas da ordem Kinetoplastida, que inclui os gêneros Trypanosoma e Leishmania, são agentes causadores de doenças negligenciadas responsáveis por diversas mortes anualmente. O Trypanosoma brucei, agente etiológico da doença do sono, é mundialmente utilizado como modelo no estudo destes protozoários devido à facilidade de cultivo em cultura e a grande gama de ferramentas e informações disponíveis na literatura. Apesar dos avanços, ainda existem grandes lacunas em relação aos processos que coordenam o metabolismo de DNA destes parasitas. A proteína Replication Protein A (RPA) é uma peça fundamental nos complexos de replicação, transcrição e resposta a danos no DNA em eucariotos. Esta proteína heterotrimérica, composta pelas subunidades RPA-1, RPA-2 e RPA-3, é a principal ligante de fita simples de DNA em eucariotos. Em tripanossomatídeos, a proteína RPA já foi caracterizada pelo nosso grupo e, assim como em outros eucariotos, está envolvida na replicação e na resposta a danos no DNA. Curiosamente, a proteína RPA-1 destes protozoários não possui o domínio 70N, responsável pela interação de RPA com diversas proteínas importantes nas vias de reparo de DNA e sinalização de checkpoint, levantando questões em relação à conservação das vias canônicas de resposta a danos descrita em eucariotos. Através de ensaios de imunoprecipitação realizados pelo nosso grupo recentemente utilizando-se RPA-2 como isca, foi encontrada uma nova proteína RPA-like (com o domínio C-terminal semelhante à RPA-1) interagindo com o complexo RPA de T. brucei. Esta proteína parece ser exclusiva do grupo de tripanossomatídeos e seu papel ainda é desconhecido. Neste projeto, temos como objetivo clonar, expressar e purificar esta nova proteína RPA-like de T. brucei, bem como checar sua capacidade de ligação ao DNA simples fita e sua possível participação na replicação e resposta a danos de DNA nestes organismos.