Identificação do perfil de hidroximetilação do DNA genômico durante a progressão do melanoma

Resumo

Nosso modelo in vitro de progressão do melanoma utiliza bloqueio de adesão ao substrato como fator de transformação maligna. As linhagens correspondentes às fases de progressão do melanoma são: melan-a (melanócitos não tumorigênicos), 4C (melanócitos pré-malignos), 4C11- (melanoma não metastático) e 4C11+ (melanoma metastático). Os níveis gênicos e proteicos de TET2 e níveis de 5hmC encontram-se elevados na linhagem 4C11+ em comparação com as outras. Essa linhagem foi escolhida para o silenciamento estável de TET2 e os clones obtidos foram avaliados quanto às capacidades de proliferação, formação de colônias, resistência à dacarbazine, resistência à morte por anoikis e migração coletiva. Elas apresentaram um aumento das capacidades de resistência ao anoikis e migração coletiva.Em estágios avançados de melanoma humano, a perda de TET2 e 5hmC são marcadores de aumento de agressividade e pior prognóstico. Como a linhagem metastática 4C11+ mostrou os maiores níveis de Tet2 e 5hmC, nós hipotetizamos que o microambiente tumoral poderia levar à perda de 5hmC. Portanto, nós estabelecemos linhagens originadas de tumor in situ e metástase pulmonar (linhagens T e M) em camundongos. Essas linhagens mostraram uma diminuição dos níveis gênicos e proteicos de TET2, diminuição dos níveis de 5hmC e aumento das capacidades de formação de colônia, migração coletiva e resistência ao anoikis, em comparação à linhagem 4C11+ e em um padrão consistente entre elas.Utilizando o RT2 Profiler PCR Array kit (QIAGEN), obtivemos um perfil de expressão de genes pró-metastáticos em um clone silenciado para TET2 em comparação com a linhagem parental 4C11+. Alguns genes foram escolhidos para validação por qPCR quantitative e também investigados nas linhagens T e M. Os genes Cdkn2aip, Hmmr and Ncor1, envolvidos com controle do ciclo celular, motilidade e invasão, respectivamente, mostraram perfis distintos entre as linhagens do modelo de progressão do melanoma, clones silenciados para TET2 e as linhagens T e M. Esses perfis simulam as diferentes condições existentes entre essas linhagens, sugerindo um papel ao microambiente tumoral à distribuição de 5hmC e regulação de características agressivas como migração e resistência ao anoikis. Como as linhagens 4C11+, 4C11+shTET2 #3 (clone silenciado para TET2), 4C11+ T1 (linhagem estabelecida de tumor in situ) e 4C11+ M2 (linhagem estabelecida de metástase pulmonar) apresentam características semelhantes em relação à resistência ao anoikis, migração coletiva e formação de colônia, mas diferentes níveis de 5hmC, foram escolhidas para a investigação das mudanças ocorridas durante a progressão do melanoma em estágios avançados, considerando também o papel do microambiente tumoral.O próximo passo nesse estudo será a identificação dos perfis de metilação e hidroximetilação das linhagens escolhidas, sua relação com o metiloma e transcriptoma já obtidos das linhagens de nosso modelo original de progressão do melanoma (melan-a, 4C, 4C11- e 4C11+), avaliação de expressão gênica diferencial e vias complexas, e a validação em bancos de dados de melanoma humano. (AU)