Construção e caracterização de um sistema replicon sub-genômico do ZIKV para a descoberta de agentes antivirais.

Resumo

Um surto de febre zika atingiu as Américas em 2015 e se tornou uma grande epidemia em 2016, levando a Organização Mundial da Saúde (OMS) a declarar estado de emergência internacional. No Brasil, o vírus Zika (ZIKV) tem sido associado a malformações congênitas e doenças neurológicas graves, como a microcefalia e a síndrome de Guillain-Barré. Considerando o risco de outra epidemia do ZIKV e a ausência de tratamento efetivo e profilático contra o vírus, o desenvolvimento de ensaios antivirais rápidos e confiáveis que permitam a análise de grandes bibliotecas de compostos é um grande desafio para a descoberta de drogas anti-ZIKV. O replicon é um sistema sub-genômico auto-replicante no qual os genes que codificam as proteínas estruturais do vírus são substituídos por um gene repórter, como uma luciferase ou uma proteína fluorescente. Os efeitos inibitórios dos compostos na replicação do RNA viral podem ser facilmente avaliados medindo-se a redução dos sinais luminescentes ou fluorescentes. O objetivo do projeto proposto é a construção e a caracterização de um replicon do ZIKV expressando o gene repórter da Renilla luciferase (Rluc). Utilizaremos técnicas de biologia molecular padrão, como PCR e clonagens, para montar o cassete de expressão do replicon contendo o gene Rluc, e inseri-lo no plasmídeo pUC57 de propagação em E. coli junto a um promotor T7. Uma vez obtido o plasmídeo com a construção do replicon, iremos transfectar células de mamíferos (linhagem BHK) com o mRNA proveniente dessa cepa. A expressão das proteínas virais será avaliada por imunofluorescência indireta e a competência de replicação do replicon será analisada pela medida de atividade da luciferase. Uma vez padronizada, essa linhagem celular será base para os testes de novos agentes antivirais em nosso laboratório. Este projeto está vinculado ao projeto CEPID CIBFar da FAPESP, e tem também como objetivo estabelecer uma base para estudos de vários vírus em nosso laboratório.