Avaliação dos efeitos da toxina do Bacillus anthracis reengenheirada, ativada pela uroquinase (uPA) e metaloproteinases (MMPs), em Hemangiossarcoma canino: estudos in vitro e in vivo

Resumo

Hemangiossarcoma (HSA) é uma Neoplasia maligna oriunda de células endoteliais. Em cães é uma neoplasia bastante agressiva, onde metástases são frequentes e as terapias existentes proporcionam apenas um benefício mínimo. A investigação de novas alternativas terapêuticas é necessária para o desenvolvimento de tratamentos mais eficazes contra esta Neoplasia. Uma toxina reengenheirada e purificada do Bacillus anthracis, ativada pela uroquinase (uPA) e metaloproteinase (MMP), denominada PA-U2-R200A + PA-L1-I210A + LF foi produzida pelo grupo do Prof. Shihui Liu e do Dr. Stephen Leppla, e Liu et al., 2016, demonstraram que esta toxina tem ação antineoplásica também contra células endoteliais vasculares. O objetivo deste estudo é avaliar, in vitro e in vivo, os efeitos das toxinas reengenheiradas do Bacillus anthracis em Hemangiossarcoma canino, comparando com células endoteliais normais. A toxina será cedida pelo laboratório de doenças parasitárias do National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, EUA em parceria com o Prof. Dr. Shihui Liu. Linhagens de Hemangiossarcoma de cães serão cultivadas e testadas quanto à expressão de metaloproteinases, uroquinase (uPA), e receptor de uroquinase (uPAr). As linhagens serão tratadas com a toxina reengenheirada, e posteriormente serão avaliadas quanto à diminuição da viabilidade celular (teste do MTT ou cristal violeta), apoptose (Click-iT TUNEL Alexa Fluor Imaging) e alterações na progressão do ciclo celular (Citometria de fluxo). Linhagens de células endoteliais caninas normais (CnAOEC) serão também cultivadas e submetidas ao tratamento com as toxinas para efeito de comparação com as células neoplásicas. Para o experimento in vivo em camundongos, células de Hemangiossarcoma canino, bem como células endoteliais normais, serão inoculadas em "hollow fibers" os quais, por sua vez, serão implantados no subcutâneo de camundongos BALB/c nu/nu. Em seguida, os camundongos serão tratados sistemicamente com as toxinas. Verificar-se-á os a dose necessária para diminuir a população de células neoplásicas nos "hollow fibers". Num estudo paralelo, amostras de Hemangiossarcoma canino oriundas de arquivos (cerca de 42 casos) serão utilizadas para confeccionar um bloco de TMA (tissue microarray). Lâminas obtidas destes blocos serão submetidas à marcação, por imuno-histoquímica, de metaloproteinases, UPA e UPAr, além de TIMP. Os resultados destas marcações serão analisados, e será possível conhecer melhor se casos espontâneos de Hemangiossarcoma canino são potencialmente suscetíveis ao tratamento com as toxinas. Espera-se, desta forma, obter informações sobre a eficácia da toxina engenheirada contra o Hemangiossarcoma canino. Desde que positivos os resultados, pretende-se realizar, num futuro próximo, testes clínicos em cães. (AU)