Ensaio de complementação trofectodérmica para células IPS: uma proposta para avaliação da pluripotência na espécie bovina

Resumo

Após o surgimento da reprogramação celular induzida, realizada a partir da inserção dos fatores de transcrição "Yamanaka" (Oct4, Sox2, Klf4 e cMyc) em células somáticas, tornam-se crescentes os estudos quanto a geração e manutenção da pluripotência. Ainda existe a necessidade de investigações mais detalhadas quanto o estado de pluripotência destas células, uma vez que diferentes protocolos, caracterizações e finalidades são utilizados para tanto. Uma das principais incógnitas em torno das iPSCs é o quão preservado seria este estado de pluripotência. Uma das principais ferramentas utilizadas para investigar o estado de pluripotência de células tronco (embrionárias ou induzidas) é através da formação de quimeras embrionárias. Dentro deste contexto, em camundongos, a partir do ensaio de complementação tetraploide (TCA) é possível gerar um novo indivíduo que tenha seu genótipo majoritariamente/exclusivamente oriundo das células tronco pluripotentes utilizadas na formação da quimera embrionária. No entanto, o TCA não tem a mesma eficiência na espécie bovina e, assim, elaboramos uma nova estratégia para alcançar este objetivo. Esta nova estratégia foi denominada de ensaio de complementação trofectodérmica (TrCA) e deu origem a um processo de patente (em análise). Assim, a presente proposta visa gerar células-tronco bovinas induzidas ao estado de pluripotência (biPSCs) em seu estado "naive" de diferenciação celular. A partir destas células serão produzidas quimeras embrionárias com diferentes metodologias (TCA e TrCA) com o intuito de originar novos indivíduos derivados majoritariamente/exclusivamente de biPSCs. As biPSCs serão cultivadas em diferentes meios suplementados com inibidores de diferenciação, sabidamente facilitadores da manutenção da pluripotência (2i, LIF e 2i+LIF). Estas biPSCs serão analisadas para o perfil de expressão de genes marcadores de pluripotência e usadas para a formação de quimeras embrionárias (experimento I). Após a seleção do melhor sistema de cultura para biPSCs, embriões quiméricos serão produzidos in vitro por agregação das biPSCs com embriões bovinos (diploides ou tetraploides) ou com fragmentos de trofectoderme de embriões produzidos in vitro. A fim de caracterizar a competência dos embriões produzidos, os blastocistos quiméricos serão analisados quanto a expressão de genes relacionados à qualidade embrionária, quanto à disposição de organelas e núcleo por análise ultraestrutural (descritiva) e quanto à imunolocalização para a diferenciação de tecidos embrionários (experimento II). Ainda, os embriões quiméricos serão transferidos para receptoras e a prenhez será diagnosticada por ultrassonografia. Quando uma gestação (até o 60º dia) for obtida, serão coletados os tecidos embrionários e extraembrionários para que estes sejam analisados quanto à sua origem (biPSC ou embrião; experimento III). Os resultados obtidos nesta proposta proverão respostas importantes e inéditas acerca da manutenção do estado de pluripotência de biPSCs e quanto à capacidade destas em formar novos indivíduos por meio do ensaio TrCA em bovinos. (AU)