Teste diagnóstico metagenômico de patógenos virais através de sequenciamento por nanoporos

Resumo

O avanço das tecnologias de sequenciamento e novas metodologias têm possibilitado o uso de abordagens inovadoras para o diagnóstico metagenômico de patógenos causadores de doenças em humanos, sobretudo patógenos virais. Vários trabalhos na literatura da área descrevem o uso de sequenciamento de nova geração para a identificação de patógenos virais que métodos tradicionais não haviam sido capazes de diagnosticar, como por exemplo, o caso de um astrovirus causador de uma encefalite fulminante em um paciente no Reino Unido. Mais recentemente, pesquisadores têm demonstrado grande interesse em aliar a tecnologia de sequenciamento single molecule oxford nanopore a estudos metagenômicos. O aparelho portátil MinION permite o sequenciamento de amostras em tempo real com a geração de bibliotecas e realização de corridas utilizando o mínimo de procedimentos e de equipamentos de laboratório. Além disso, enfermidades como Dengue, Zika, Chikungunya e febre amarela, por exemplo, apresentam patógenos cujo material genético encontra-se na forma de moléculas de RNA genômico que podem ser acessadas através de abordagens metagenômicas e do sequenciador portátil MinION. Sendo assim, o uso de sequenciamento metagenômico para o diagnóstico unificado de diversos vírus de RNA desponta como uma ferramenta promissora para tornar a identificação de infecções por vírus de RNA mais rápida e precisa. Esta proposta PIPE tem como objetivo principal o desenvolvimento de um fluxo de trabalho para diagnóstico metagenômico rápido e preciso de patógenos virais, baseado em análises computacionais de dados de sequenciamento por nanoporos. Há dois principais desafios técnicos/científicos no desenvolvimento deste projeto. O primeiro, de natureza experimental, diz respeito à consolidação de um protocolo para extração e purificação de RNA viral, além da amplificação de cDNA metagenômico de forma randômica. Estes procedimentos devem gerar material genético suficiente para o sequenciamento através do aparelho portátil MinION oxford nanopore. Já o segundo desafio consiste em testar a viabilidade da técnica de sequenciamento para o diagnóstico de pan-patógenos em amostras metagenômicas. Para tal, será desenvolvido um pipeline de análises bioinformáticas para manipular os dados de sequenciamento e realizar a identificação e diagnóstico dos patógenos nas amostras. Esse desafio envolve ainda, a criação de um módulo final que será capaz de gerar saídas HTML informativas e de fácil compreensão para o usuário. Para esta primeira fase do PIPE, esperamos obter um protocolo experimental definido para purificação, extração e amplificação de RNA viral em amostras biológicas controladas. Esperamos ainda, nos familiarizar com a nova tecnologia de sequenciamento Nanopore e obter dados que corroborem para a viabilidade na geração de sequências metagenômicas que permitam a identificação eficiente de patógenos virais e o correto diagnóstico para uma série de vírus de RNA em amostras clínicas. Acreditamos que há grande potencial para a criação de um teste diagnóstico a partir destes resultados que seria capaz de oferecer informações de diversidade de microrganismos na amostra, assim como o correto diagnóstico para uma série de patógenos de grande impacto na população. Além disso, o teste seria genérico no sentido de identificar patógenos sem requerer conhecimento prévio da composição da amostra e sem a necessidade de amplificações direcionadas, como é o caso da quase totalidade dos testes disponíveis hoje no mercado de diagnóstico viral. (AU)