Caracterização estrutural, funcional e análise da resposta imune in vivo de uma serinoprotease recombinante de Crotalus durissus collilineatus modificada por PEGlação

Resumo

As serpentes pertencentes ao gênero Crotalus são classificadas, filogeneticamente, como pertencentes à superfamília Colubroidea, família Viperidae e subfamília Crotalinae. Fazem parte deste gênero aproximadamente 29 espécies e, na América do Sul, os exemplares encontrados são representados pela espécie Crotalus durissus. Entre os constituintes da peçonha destas espécies, encontra-se uma alta concentração de crotoxina, toxina majoritária da peçonha, com ação neurotóxica, além de metaloproteases, serinoproteases, fatores de crescimento, entre outros compostos. As serinoproteases de peçonhas de serpentes são capazes de afetar o sistema hemostático de suas vítimas, dada a semelhança destas toxinas com enzimas endógenas, presentes nas vias de ativação do sistema de coagulação, fibrinólise e agregação plaquetária. Desta maneira, são consideradas como promissores agentes terapêuticos, além de ferramentas biotecnológicas. A expressão de toxinas em sistemas heterólogos é um processo importante na transição de toxina a agente terapêutico, uma vez que possibilita a obtenção destas biomoléculas em quantidades suficientes para estudos mais aprofundados e, possivelmente, comercialização do novo biofármaco. Por outro lado, é conhecida a imunogenicidade desencadeada pela administração de proteínas exógenas em diversos organismos, ocasionando a destruição do biofármaco e, consequentemente, a perda de atividade terapêutica. A PEGlação, processo de modificação química no qual há a conjugação de polietilenoglicol (PEG) às proteínas, visa reduzir a velocidade deste processo e de diversos outros fatores envolvidos na degradação destas biomoléculas in vivo. Desta forma, o presente projeto propõe a purificação de uma serinoprotease de interesse biotecnológico da peçonha de Crotalus durissus collilineatus, bem como sua expressão em sistema heterólogo, purificação da proteína recombinante e conseguinte PEGlação, utilizando um derivado de PEG, denominado m-PEG-Maleimide. Estudos de caracterização bioquímica funcional e determinação da especificidade dos subsítios enzimáticos serão realizados visando a elucidação das propriedades funcionais destas enzimas. A resposta imune, desencadeada pela enzima nas suas formas recombinante e recombinante PEGlada, também será avaliada, a fim de determinar se a PEGlação desta biomolécula é capaz de reduzir a imunogenicidade in vivo. Adicionalmente, estudos in vitro envolvendo a ativação do sistema complemento pelas enzimas recombinante e recombinante PEGlada serão realizados. Em relação à caracterização estrutural, as estruturas tridimensionais da enzima nas formas nativa e recombinante serão propostas através de modelagem molecular, além da determinação dos seus diferentes padrões de glicosilações. (AU)