Caracterização funcional in silico e in vitro de variantes no gene PCSK9 identificadas em pacientes com hipercolesterolemia Familial

Resumo

A Hipercolesterolemia Familial (HF) é uma doença genética do metabolismo das lipoproteínas, caracterizada pelo aumento do colesterol plasmático, transportado principalmente pela lipoproteína de baixa densidade (LDL). A HF é causada principalmente por mutações nos genes LDLR, APOB e PCSK9. As mutações conhecidas no PCSK9 podem levar ao aumento ou diminuição da função proteolítica da proteína, as quais são associadas ao aumento ou diminuição da LDL-c plasmática, respectivamente. Com o projeto genoma humano surgiram novos métodos de sequenciamento, o que resultou em um grande número de novas variantes genéticas relacionadas à HF. Entretanto, os mecanismos pelos quais essas variantes influenciam a concentração do colesterol e sua interferência na resposta terapêutica não estão totalmente elucidados. O objetivo do presente projeto é avaliar in silico e in vitro o efeito de variantes no gene PCSK9 identificadas em pacientes com Hipercolesterolemia Familial utilizando sequenciamento de nova geração. Os métodos que serão utilizados: (i) análise in silico das variantes; (ii) docking molecular; (iii) cultivo das linhagens HepG2 e HUVEC; (iv) mutagênese sítio-dirigida das variantes utilizando o Phusion Site-Directed Mutagenesis Kit; (v) transfecção das construções com as variantes em células HepG2 e HUVEC utilizando Lipofectamine 2000; (vi) avaliação da captação de LDL nas células, HepG2 e HUVEC transfectadas, por citometria de fluxo. Este estudo está em andamento desde Julho de 2016, o qual já finalizou as análises in silico e docking molecular das variantes R237W, A443T, R469W e Q619P. Para as variantes R237W e R469W foi observado uma possível alteração conformacional que poderia aumentar a afinidade da PCSK9 pelo LDLR. Também foi realizado o sequenciamento por Sanger da variante E32K, a qual possivelmente está associada a HF em uma família brasileira com ascendência japonesa. Espera-se que os resultados deste estudo possam contribuir para o conhecimento dos possíveis impactos funcionais dessas variantes em pacientes com HF. (AU)