Importância gene WEE1 e efeitos da sua inibição para a sobrevida células-tronco tumorais do Mieloma Múltiplo

Resumo

O mieloma múltiplo (MM) é uma neoplasia hematológica maligna caracterizada pela infiltração de plasmócitos tumorais na medula óssea (MO), síntese e secreção de imunoglobulinas clonais e danos teciduais como lesões ósseas, hipercalcemia, anemia e insuficiência renal. Apesar do avanço no tratamento, o MM permanece incurável devido à alta taxa de recaída. A presença de células-tronco tumorais (cancer stem cells, CSCs) é apontada como causa predominante na resistência a drogas e recaída da doença, tornando-as possíveis alvos terapêuticos. Apesar de não existir um antígeno universal para a identificação destas células, é possível identificá-las e isolá-las com base nas suas características intrínsecas. Este estudo baseia-se no trabalho de Boucher et al (2012), que utilizou o padrão de expressão de antígenos de superfície (CD34+/CD138-) e a atividade de uma enzima da família aldeído desidrogenase (ALDH) para identificar as MM-CSC. JUSTIFICATIVA: De acordo com os resultados descritos em Dantonio et al (2016), foi possível isolar em nosso laboratório as MM-CSCs imunofenotipicamente (CD138-/CD34+), funcionalmente (ALDH1-positivas) e através do perfil de expressão gênica. A análise do perfil de expressão gênica das MM-CSCs mostrou genes diferencialmente expressos em relação aos plasmócitos tumorais, entre eles, o gene WEE1. A proteína WEE1 é um modulador negativo da entrada da célula na mitose, regulando o checkpoint G2-M através da fosforilação da molécula CDC2. A inibição de WEE1 impulsiona a célula para a mitose precoce levando-a à apoptose, característica que tem sido explorada como estratégia terapêutica em outros tumores. O inibidor MK-1775 inibe a WEE1 kinase e atua competindo com ATP, evitando o reparo do DNA, surtindo efeito antiproliferativo. Em MM, Tabayashi et al (2016) investigaram o papel de WEE1 em MM como um potencial alvo terapêutico utilizando MK-1775. Os ensaios mostraram que o MK-1775 isolado inibiu a proliferação de várias linhagens celulares MM, induzindo apoptose precoce e tardia nas células. Além disso, em células resistentes a bortezomibe (BTZ), a droga MK-1775 supera tal resistência e ressensibiliza as células quando em combinação com BTZ. Os dados de Tabayashi et al em linhagens celulares de MM, aliados aos nossos resultados em MM-CSCs obtidas de pacientes com MM sugerem a molécula WEE1 como possível alvo terapêutico que pode ser explorado. OBJETIVOS: Identificar a presença de possíveis MM-CSCs em linhagens celulares de MM RPMI-8226 e U266, avaliando sua expressão gênica de WEE1 e os efeitos que inibidores de WEE1 produzem na apoptose celular. MÉTODOS: As linhagens celulares de MM RPMI-8226 e U266 serão cultivadas e submetidas a sorting magnético para pré-seleção do perfil CD138-. Em seguida, as células selecionadas serão submetidas à citometria de fluxo pelo FACS Aria II para identificação da marcação através dos anticorpos, anti-CD34 PE Cy7, anti-CD138 APC e do reagente Aldefluor". O material obtido será colocado em cultura para avaliar a formação de esferas. Em seguida, as células serão tratadas com inibidores do gene WEE1 (MK-1775). Após 48 horas, será avaliada a apoptose tardia por citometria de fluxo no FACSCalibur, utilizando como parâmetro as marcações com anexina V+ e PI+. Serão utilizados o kit RNeasy Mini kit e a transcriptase reversa SuperScript III para extração do RNA e síntese do cDNA, respectivamente. Por fim, por meio do PCR quantitativo em tempo real (qPCR) será realizada a quantificação da expressão do gene WEE1. (AU)