Influência de vesículas extracelulares no metabolismo lipídico e no desenvolvimento e qualidade de embriões bovinos produzidos in vitro

Resumo

A produção in vitro de embriões (PIVE) é uma biotécnica aplicada à reprodução amplamente utilizada para fins de melhoramento genético e incremento na produção animal, sendo o Brasil o maior produtor mundial. Embora utilizada comercialmente com sucesso, a PIVE apresenta ainda alguns fatores limitantes para redução de custos e maior disseminação relacionados com a menor qualidade dos embriões gerados e a consequente maior sensibilidade dos embriões de produção in vitro (PIV) à criopreservação. A menor criotolerância de embriões PIV, por sua vez, parece ser relacionada com o maior acúmulo de lipídios nestes em comparação com os produzidos in vivo. As razões para esse maior acúmulo ainda não foram esclarecidas, mas mostram relação com alterações no metabolismo lipídico ocasionadas pelas condições de cultivo in vitro (CIV) usuais com presença de soro fetal bovino (SFB) no meio de cultivo. Estudos recentes mostraram que o cultivo de embriões de PIV na presença de células epiteliais de oviduto bovino ou de vesículas extracelulares produzidas (extracellular vesicles, EVs) por essas células ou presentes no fluido de oviduto (FO), ou ainda com FO e fluido uterino (FU) associados em cultivo sequencial, leva à produção de embriões de melhor qualidade e maior criotolerância. Por outro lado, também foi observado que o SFB, utilizado nos sistemas de cultivo in vitro, quando depletado de suas EVs (SFBdep), também melhora a criotolerância embrionária, sugerindo que as EVs do SFB possam contribuir para a pior qualidade e criotolerância dos embriões PIV. No entanto, possíveis efeitos das EVs sobre o metabolismo lipídico e sua relação com qualidade dos embriões não foram determinadas. EVs são vesículas secretadas por diversas células e que contém produtos variados como proteínas e RNAs, dentre outras moléculas. As células que captam tais conteúdos podem ter sua expressão gênica e atividade metabólica afetada pelas mesmas e já foi observado que embriões são capazes de captar tais EVs. Assim sendo, o objetivo do presente projeto é de investigar o papel das EVs de FO e de FU (EVO e EVU) no metabolismo lipídico de embriões bovinos produzidos in vitro na sua presença durante o cultivo in vitro (CIV). Para tanto, no Experimento 1, embriões PIV serão mantidos em CIV por 7 dias nos grupos: 1) controle+ com SFB, 2) controle- com SFBdep, 3) com EVO de D1-4 seguido de EVU de D5-7 (EVO-EVU) ou 4) com EVO-EVU na presença de SFBdep (EVO-EVUdep). Ao final da CIV, os embriões produzidos serão analisados por microscopia de fluorescência confocal para quantificação do teor de lipídios por coloração com Nile Red e co-localização de PLIN2 (proteína indicadora de acúmulo lipídico) com as gotas lipídicas. No Experimento 2, será avaliado o efeito dos tratamento sobre o metabolismo lipídico pela avaliação dos níveis de HSL ativada (enzima de lipólise) e de FAS (enzima de lipogênese) por western blotting. No Experimento 3, embriões produzidos nos diferentes grupos serão avaliados por qPCR em relação à abundância de transcritos de genes relacionados ao controle do metabolismo lipídico. No Experimento 4, as EVs serão avaliadas por RNAseq em relação ao seu transcriptoma (RNAm) relacionado ao metabolismo lipídico, para identificar possíveis genes candidatos a influenciarem o metabolismo lipídico dos embriões. Alguns desses genes serão selecionados e avaliados nos embriões como forma de identificar sua possível captação.