Expressão, purificação e caracterização da proteína morfogenética humana (BMP-2) para aplicação em biomateriais compósitos com o polímero poli(e-caprolactona)

Resumo

O presente projeto, cuja Fase-1 será completada em 31 de janeiro de 2017, e do qual já foi encaminhado relatório parcial relativo aos primeiros seis meses, prevê a síntese nacional e caracterização da proteína morfogenética humana recombinante (rhBMP-2). Na Fase-1, de acordo com o delineamento proposto para prova de conceito e viabilidade técnica, demonstrou-se pela primeira vez uma expressão periplásmica da BMP-2 em Escherichia coli, mediante testes preliminares de identidade, pureza e potência. Esta última, confirmada mediante ensaio biológico com células mioblásticas C2C12, mostrou se tratar de um produto biologicamente ativo, com potência provavelmente >90% relativamente ao padrão de BMP-2 humana, produzida no citoplasma de E.coli e distribuída pela GenScript (Piscataway, NJ, USA). Os rendimentos aproximados foram da ordem de 1 µg/ml/A600, o que permitiu uma primeira purificação e parcial caracterização desta proteína. Na Fase-2 do projeto será realizado um estudo dirigido a um aumento significativo dos rendimentos da produção, cuja meta é a obtenção de biomassas da ordem de 30-60 A600 e de rendimentos de expressão de pelo menos 2-4 µg/ml/A600, utilizando diferentes vetores de expressão, diversas cepas bacterianas e, especialmente, condições de fermentação com parâmetros de bioreação altamente controlados em Biorreator Laboratorial de 20 litros (MBR, Zurich, Suíça) e, possivelmente, industrial/piloto de 150 litros. Outra meta será também aperfeiçoar o procedimento de purificação ("downstream processing") com rendimentos de purificação da ordem de 40-60%, com pureza >95%. A nossa empresa (Biosintesis) já detém plataforma tecnológica e propriedade intelectual para a obtenção e preparação do polímero poli(µ-caprolactona) (PCL) e consequente obtenção de compósitos biologicamente ativos. Nesta mesma Fase 2 serão, portanto, obtidos e testados compósitos formados por PCL e rhBMP-2 e por PCL e hormônio de crescimento humano (hGH). A incorporação dos compostos ativos hrBMP-2 e hGH proporcionarão protótipos e formulações para estudos comparativos de osteoindução. O hGH é uma proteína sobre a qual o grupo de pesquisa deste projeto detém extensivo domínio tecnológico com publicações e patente depositada pelo Centro de Biotecnologia (CB) do IPEN. Trata-se de um hormônio que já demostrou ampla atividade osteogênica. Assim, os efeitos osteoindutivos, próprios da rhBMP-2, serão testados, em comparação com o hGH, em modelo animal de roedores para estudos de "eficácia de osteintegração" e também em modelo de "Osteogenesis Imperfeita" (OI). Este último modelo está em fase de desenvolvimento no biotério do CB, as matrizes destes animais mutantes (camundongos "oim") tendo sido adquiridas no Jackson Laboratory (EUA) graças à projeto de auxílio FAPESP ligado a atividades de terapia gênica de crescimento do mesmo CB-IPEN (Proc. 2014/19757-7). (AU)