Avaliação da atividade proteolítica de proteases secretadas por leptospiras patogênicas na fagocitose por fagócitos humanos e murinos

Resumo

A Leptospirose é uma zoonose causada por bactérias espiroquetas que pertencem ao gênero Leptospira. Muito frequente em áreas tropicais e subtropicais, a doença representa um grave problema de saúde pública. Leptospiras patogênicas possuem a habilidade de escapar do sistema complemento, sendo capazes de sobreviver quando em contato com soro normal. Em um estudo anterior realizado por nosso grupo, observou-se que várias espécies de leptospiras patogênicas foram capazes de secretar proteases que clivam proteínas do complemento como a molécula central C3, assim como seus fragmentos, C3b e iC3b, além de proteínas da via alternativa (Fator B), via clássica e via das lectinas (C4b e C2). Durante o meu mestrado, verificamos que tais proteases também foram capazes de clivar as proteínas purificadas C6, C7, C8 e C9 do MAC, ao passo que as não patogênicas não apresentaram atividade proteolítica significante sobre estes substratos. Ensaios utilizando inibidores de protease revelaram uma inibição da atividade proteolítica pela 1, 10-fenantrolina, indicando a participação de metaloproteases. Dentre estas, conseguimos comprovar a atividade proteolítica da termolisina recombinante LIC13322, uma metaloprotease expressa exclusivamente por estirpes patogênicas de leptospira. Esta termolisina recombinante foi capaz de clivar o componente C6, tanto isolado quanto como parte integrante do complexo SC5b-9. Além disso, verificamos que as proteínas do MAC são capazes de interagir com a termolisina recombinante, indicando que esta protease pode exercer um efeito inibitório adicional sobre estas moléculas por um possível mecanismo de inibição por interação direta. Poucos estudos procuraram até o momento desvendar porque leptospiras patogênicas são mais refratárias à fagocitose do que as espécies não patogênicas. Nossa hipótese de trabalho é que proteases secretadas por leptospira patogênica poderiam interferir na sua internalização e morte dentro dos fagócitos. Neste projeto, avaliaremos se tais enzimas serão capazes de clivar receptores e opsoninas presentes nas superfícies de fagócitos afetando, portanto, o reconhecimento da bactéria por essas células. A opsonização é um dos mecanismos mais importantes que ocorrem durante a fase de ativação do complemento, sendo os fragmentos C3b, iC3b e C4b responsáveis por se ligarem covalentemente na superfície de diferentes patógenos. Esse processo de fagocitose pode ser facilitado mediante a interação dessas opsoninas com receptores específicos (ex: Fc³R, CR1 e CR3) presentes nas superfícies de células fagocitárias como neutrófilos e macrófagos. Outros receptores são bastante importantes para o reconhecimento de patógenos por macrófagos e neutrófilos, entre eles: TLR que, após a interação com PAMPs, desencadeia a liberação de sinais intracelulares que culminam na indução de fatores de transcrição de genes importantes para a resposta imune; receptor de manose que reconhece certos açúcares terminais presentes nos carboidratos da superfície microbiana; e receptor scavenger que foram inicialmente identificados pela sua capacidade de reconhecer e remover lipoproteínas modificadas. A evasão da resposta imune do hospedeiro permite a disseminação do patógeno, favorecendo o estabelecimento da infecção. Portanto, consideramos importante investigar o papel das proteases secretadas por leptospiras patogênicas sobre os fagócitos. Acreditamos que a identificação de alvos biológicos das proteases de leptospira é de grande importância para o melhor entendimento da patogênese da doença, bem como também poderá contribuir para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas e/ou preventivas na infecção por estes patógenos. (AU)