Aplicação dos métodos STELA, Telo-PCR e RNA-FISH para estudar a manutenção e transcrição dos telômeros em Leishmania spp

Resumo

Telômeros são estruturas nucleoproteicas que protegem as extremidades cromossômicas de fusão e degradação. Embora tenham sido considerados silenciados transcricionalmente, recentemente foi demonstrado que os telômeros de diferentes eucariotos são transcritos em longos RNA não codantes (lncRNA). Em diferentes Kinetoplastida, incluindo Leishmania, foi mostrado previamente que os telômeros são transcritos por diferentes tipos de RNA polimerases. No entanto, até o momento, não está claramente definido o sítio de início da transcrição e de qual fita telomérica os transcritos são gerados. TERRA (telomeric repeat-containing RNA) é um lncRNA transcrito a partir da região subtelomérica em direção à extremidade 3´das repetições teloméricas, usando como molde a fita telomérica rica em C. Várias evidências indicam que TERRA é essencial para a manutenção dos telômeros, para a regulação do cumprimento dos telômeros, da atividade da telomerase e da conformação da heterocromatina. Embora a biogênesis do TERRA seja bem definida as funções associadas ao TERRA são ainda controvérsias. Nós checamos a expressão do TERRA durante o ciclo de desenvolvimento de Leishmania usando bibliotecas SL-Seq construídas a partir das três formas de vida do parasito (promastigota, metaciclica e amastigota). Posteriormente validamos esses resultados usando northern blot e RT-PCR. As análises de northern blot e RT-PCR confirmam a existência dos transcritos de TERRA em Leishmania compreendendo regiões subteloméricas seguidas de tratos de repetições teloméricas, de tamanho variável, da fita rica em G. Transcritos TERRA poliadenilados originados de alguns, mas não de todos os terminais de cromossomos do parasito (braço esquerdo e direito) foram identificados, sugerindo regulação em nível transcripcional nos telômeros de Leishmania. A expressão do TERRA em Leishmania indica que a transcrição do telômero é altamente conservada entre os eucariotos. O objetivo deste projeto é ganhar conhecimento nas técnicas STELA, Telo-PCR e RNA-FISH as quais serão respectivamente aplicadas ao estudo da manutenção e transcrição do telômero em Leishmania major. Nós acreditamos que essas ferramentas nos ajudarão a entender o papel de TERRA nos telômeros de Leishmania major e a associação de suas funções no parasita. (AU)