Caracterização de um inibidor de fosfolipase A2 da glândula de peçonha de Crotalus durissus terrificus: um possível adjuvante na terapia do envenenamento

Resumo

Os acidentes por serpentes representam um sério problema de saúde pública em diversos países. No Brasil, foram notificados mais de 170 mil casos de acidentes cuja maioria é decorrente de picadas de serpentes do gênero Bothrops. Entretanto, é o gênero Crotalus o que apresenta o maior índice de letalidade. As serpentes desse gênero são popularmente conhecidas como cascavéis e são representadas por uma única espécie (Crotalus durissus) no território brasileiro. A C. durissus é subdividida em seis subespécies, sendo a C. d. terrificus uma das mais prevalentes. A peçonha crotálica apresenta, principalmente, ações neurotóxica, miotóxica e na coagulação sanguínea, e seu componente majoritário é a crotoxina. A crotoxina é um complexo formado por uma fosfolipase A2 (PLA2) sem atividade catalítica (subunidade ácida) que atua como uma chaperona para a PLA2 cataliticamente ativa (subunidade básica), direcionando-a a sítios específicos que levam principalmente a ações neurotóxicas. A crotoxina é a principal responsável pela morte no envenenamento crotálico, devido ao bloqueio causado na transmissão neuromuscular, levando a vítima a uma parada respiratória. O tratamento atual do envenenamento é feito através da administração de soro antiofídico, produzido a partir da purificação de imunoglobulinas de cavalos, que foram previamente hiperimunizados com a(s) peçonha(s) de interesse. Embora seja eficaz, a utilização do soro pode levar a muitas reações adversas na vítima (tanto precoces quanto tardias), que incluem até mesmo um quadro de choque anafilático e o desenvolvimento da "doença do soro". Inibidores de PLA2 (PLIs) que estão no sangue de serpentes como parte de um mecanismo inato de defesa contra a própria peçonha e/ou a peçonha de outras serpentes já demonstraram atividades antimiotóxicas ou antineurotóxicas. Esses inibidores são classificados em três grupos (±, ² ou ³) em função do domínio apresentado. Esse trabalho visa a caracterização de um inibidor de PLA2 da classe ², denominado CdtPLI2, recentemente detectado na glândula de peçonha de C. d. terrificus, objetivando sua utilização como adjuvante na terapia do envenenamento. Para a execução desse projeto, será construído um gene sintético com a sequência de cDNA do CdtPLI2, que será, posteriormente, expresso em Pichia pastoris e isolado do sobrenadante da cultura através de cromatografia líquida de proteínas. O inibidor recombinante será extensivamente caracterizado estruturalmente, com ênfase em sua massa molecular, modificações pós-traducionais e estrutura tridimensional. Estudos in vitro (inibição de atividade fosfolipásica e cinética enzimática de inibição) serão utilizados para caracterização da inibição da crotoxina e da PLA2 de C. d. terrificus e da inibição da atividade fosfolipásica de diferentes peçonhas de serpentes brasileiras com interesse médico. Por sua vez, através de estudos in vivo será avaliada a inibição do CdPLI2 sobre os efeitos sistêmicos e indução de edema da crotoxina e da PLA2 de C. d. terrificus. A partir de ensaios in vivo (alteração de parâmetros bioquímicos e da liberação de citocinas), também será avaliada possível toxicidade causada pela administração do CdtPLI2 recombinante. Esse estudo tem como objetivo avaliar o possível uso do CdtPLI2 recombinante como um complemento na terapia do envenenamento, por inibir os efeitos sistêmicos causados pela crotoxina. Este também será o primeiro estudo detalhado sobre um PLI da classe ². Além disso, o presente trabalho abre portas para possíveis aplicações de inibidores de PLA2 em doenças relacionadas com um aumento na atividade de fosfolipase A2 endógena no organismo. (AU)