Bioprospecção de compostos ativos da própolis orgânica com atividade sobre a migração de neutrófilos no processo inflamatório.

Resumo

A própolis orgânica (PO) é um tipo singular de própolis, pois é produzida e certificada de forma orgânica na mata Atlântica brasileira nos estados do Paraná e Santa Catarina. Em um estudo prévio, avaliamos quimicamente por CCD e Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) os extratos hidroetanólicos da PO obtidas de 14 apicultores e demonstramos que a PO pode ser agrupada em 7 perfis químicos diferentes, apresentando compostos únicos e não encontrados em outros tipos de própolis brasileiras. Neste trabalho, também mostramos que todos os perfis da PO possuem alta capacidade antioxidante, e que a PO perfil 6 (PO6) possui atividade anti-inflamatória pois inibe a ativação do fator de transcrição NF-ºB e a liberação da citocina TNF-±. Estes achados são um forte indício de que a PO6 pode inibir a migração neutrofílica, fenômeno que vem sendo considerado como o alvo ideal para o tratamento de doenças inflamatórias crônicas ainda sem tratamento efetivo, como a doença periodontal. Nossos resultados foram ainda mais evidenciados por um estudo farmacogenômico, no qual demonstramos que a PO6 é capaz de inibir a expressão de genes atribuídos a migração leucocitária. Assim, este estudo objetiva isolar e identificar os compostos da PO6 com atividade inibidora da migração de neutrófilos in vitro, in vivo e in silico, bem como elucidar seu(s) mecanismo(s) de ação. Para isto, as amostras da PO serão coletadas dos mesmos apicultores que forneceram amostras de PO para o trabalho anterior e extraídas em solução hidroetanólica. Os extratos serão avaliados por cromatografia em camada delgada (CCD) e somente aqueles com perfil semelhante a PO6 serão selecionados e submetidos a uma prospecção bioguiada por seus efeitos inibidores da migração neutrofílica in vitro. A bioprospecção será realizada com três formas de fracionamento diferentes: sílica diol, fracionamento cromatográfico com sílica em fase reversa e em gel de sephadex LH-20. A cada etapa de fracionamento obteremos frações ou subfrações da PO6, que serão submetidos a monitoramento químico (CCD) e biológico, por meio dos experimentos in vitro para avaliação da viabilidade celular, produção de citocinas pró-inflamatórias, quimiotaxia de neutrófilos e expressão de moléculas de adesão em macrófagos RAW 264.7, células endoteliais BEND-3 e neutrófilos obtidos de camundongos C57BL/6. Serão selecionadas as frações e subfrações com maior rendimento e atividade biológica e, ao final deste processo, realizaremos o isolamento e identificação do(s) composto(s) anti-inflamatório(s) in vitro da PO6 utilizando as técnicas de CLAE semi-preparativa, ressonância magnética nuclear e espectrometria de massas de alta resolução. Posteriormente, submeteremos esta(s) molécula(s) a um experimento in silico, para obtenção de suas propriedades farmacocinéticas e toxicológicas, e in vivo em camundongos C57BL/6 para confirmação da atividade inibidora da migração neutrofílica, com os experimentos de migração de neutrófilos na cavidade peritoneal, microscopia intravital, quantificação de citocinas e quimiocinas inflamatórias e expressão de moléculas de adesão. O estudo será finalizado com a elucidação dos mecanismos moleculares de ação da(s) molécula(s) ativa(s) da PO6 com a realização de um estudo farmacogenômico. Desta forma, esperamos isolar e identificar a(s) molécula(s) responsável(áveis) pelo efeito inibidor da migração neutrofílica da PO6, bem como elucidar seus mecanismos moleculares de ação e que esta(s) molécula(s) seja(m) efetiva(s) no tratamento de doenças inflamatórias de caráter imunomodulatória.