Nanofracionamento por LC-MS/MS e ensaios at-line para a identificação de compostos biativos em extratos de produtos naturais.

Resumo

Extratos de produtos naturais podem ser considerados uma valiosa fonte de metabólitos secundários biologicamente ativos. A triagem de produtos naturais para compostos bioativos já foi demonstrada como uma abordagem eficiente na descoberta de novos fármacos. No entanto, a triagem de compostos bioativos a partir de matrizes complexas, como produtos naturais, é trabalhosa, demorada e cara. Este paradigma estimula o desenvolvimento de técnicas rápidas e eficientes e abordagens analíticas eficientes que permitem a identificação e a separação de compostos com atividade biológica. Extratos naturais são misturas complexas e a concentração dos diferentes compostos bioativos nestes extratos difere em grande parte, entre os metabolitos secundários, e como tal incluem um desafio adicional para a triagem de extratos. Assim, uma combinação de separação de alta resolução e bioensaios é necessária. Métodos de separação clássicos são demorados e caros, enquanto triagem offline não resulta em informações sobre compostos individuais e muitas vezes dão resultados falsos positivos ou falsos negativos. Empregando técnicas de cromatografia, o isolamento de princípios ativos derivados de um extrato natural pode excepcionalmente ser conseguido num único passo cromatográfico. O uso de métodos cromatográficos bi-dimensionais (2D) é, por conseguinte, uma estratégia valiosa para obter a separação de forma eficiente com o tempo de análise reduzida. No entanto, surgem problemas quando a separação cromatográfica de alta resolução empregada é sucedida por um processo de fracionamento normalmente de baixa resolução e, consequentemente, um perfil da bioatividade de baixa resolução. Uma alternativa promissora é o acoplamento de estratégias de fracionamento de alta resolução, após a separação, em que muitas microfrações podem ser coletadas com intervalos de tempo mais curtos para análise da bioafinidade, mantendo assim a alta resolução obtida durante a etapa de separação. Estas frações são recolhidas em microplacas de 384 ou 1536-poços em que os reagentes do ensaio bioquímicos são simultaneamente ou posteriormente misturados. Assim, é possível detectar atividade biológica diretamente a partir dos microfrações e determinar a caracterização química dos compostos bioativos utilizando a espectrometria de massa (MS) a partir de um sistema de nanofracionamento LC-MS / MS. Para a realização de ensaios biológicos a utilização de enzimas imobilizadas é uma opção atraente. A enzima pode ser utilizada de um modo econômico uma vez que a estabilidade da enzima imobilizada aumenta permitindo a reutilização da enzima em vários ciclos, e menor tempo de incubação. Neste contexto, o objetivo deste projeto é desenvolver uma metodologia rápida e eficiente para a separação, fracionamento e identificação de componentes bioativos de plantas, extratos microbianos e venenos. As ciclooxigenases (COX-1 e COX-2) são os alvos selecionados. Estas enzimas são alvos no desenvolvimento de anti-inflamatórios não esteróidais (AINE). As enzimas serão imobilizadas individualmente por duas abordagens diferentes: em capilar de sílica fundida, produzindo bioreatores para uso em fluxo, e no fundo de placas de vidro e / ou em microesferas de vidro que irão proporcionar compatibilidade direta para nanofracionamento (a ser testado para a produção de placas biorreatores de 384 poços com enzimas imobilizadas). A inibição da atividade enzimática será adotada para identificar leads anti-inflamatórios potenciais. Após o passo de nanofracionamento além dos ensaios anti-inflamatórios, adicionalmente, também serão testados diferentes formatos de bioensaio, incluindo a atividade antibiótica por um ensaio luminescente com e-coli, em placa de 384 poços (atualmente um protocolo experimental é executado com êxito na Universidade VU) e /ou um ensaio anti-tuberculose com leitura de fluorescência (desenvolvido e pronto para ser utilizado para extrair perfis de atividade a partir de extratos naturais).