Caracterização de proteínas envolvidas na via de recombinação homóloga mitocondrial em Saccharomyces cerevisiae

Resumo

Diferente do genoma nuclear, pouco se sabe a respeito dos mecanismos responsáveis pela estabilidade do DNA mitocondrial (mtDNA). Estudos tem mostrado que quebras de dupla fita (DSBs, do inglês double strand breaks) são responsáveis por mutações e deleções no mtDNA que estão associadas à incidência de várias doenças como câncer, doenças metabólicas, neurodegenerações e envelhecimento normal. É interessante notar que a grande maioria das deleções no mtDNA são flanqueadas por sequências repetidas (DMRD, do inglês direct repeat mediated deletion), indicando que mecanismos de recombinação podem ser responsáveis por essas deleções. De fato, estudos anteriores tem mostrado que recombinação homóloga (HDR, do inglês, homologous directed repair) é um provável mecanismo de reparo de DSBs na mitocôndria. Entretanto, poucas proteínas da maquinaria de HDR foram identificadas em mitocôndrias. Além disso, embora a resposta de checkpoint de dano ao DNA seja um importante regulador da via de HDR no núcleo, pouco se sabe sobre a sua importância em resposta à formação de lesões no mtDNA. Estudos preliminares mostraram que as proteínas Fun30 e Rad54, previamente caracterizadas como importantes para HDR no núcleo, estavam enriquecidas em mitocôndrias de células tratadas com a genotoxina MMS. Dessa forma, utilizando uma linhagem de levedura que possui um sistema repórter mitocondrial capaz de quantificar o reparo de DSBs entre sequências repetidas, pretendo caracterizar a importância de Fun30 e Rad54 para a estabilidade do genoma mitocondrial. Além disso, através da utilização de um sistema capaz de hiperativar a resposta de checkpoint constitutivamente, pretendo caracterizar a importância dessa via para a manutenção do mtDNA.