Sequenciamento de DNA de segunda geração (NGS) aplicado ao diagnóstico em Microbiologia clínica

Resumo

Os seres humanos são suscetíveis a infecções causadas por uma grande diversidade de agentes patogênicos microbianos, sendo as doenças infecciosas a principal causa de mortalidade humana. Os princípios de Microbiologia aplicados no diagnóstico clínico pouco mudaram ao longo dos últimos 50 anos, sendo o diagnóstico laboratorial baseado em cultura celular e, portanto, dependente do isolamento de um organismo viável. Este projeto tem como proposta o desenvolvimento de produtos que possibilitem o diagnóstico rápido e independente de cultura celular utilizando a tecnologia de sequenciamento NGS; tendo sido comprovada a viabilidade da técnica na Fase 1. As amostras utilizadas neste projeto serão cedidas pelo Laboratório de Análises Clínicas (UNILAB) da cooperativa de trabalho médico UNIMED do município de São Carlos e pelo setor de Microbiologia do Laboratório Clínico do Hospital Israelita Albert Einstein (HIAE). A extração de DNA a partir de amostras clínicas será realizada de forma automatizada utilizando a metodologia de purificação por beads magnéticas. As bibliotecas de DNA adequadas para o sequenciamento serão preparadas utilizando kit Nextera® XT Sample Preparation (Illumina) e as corridas de sequenciamento realizadas no sequenciador MiSeq Desktop Sequencer (Illumina) disponível no laboratório da empresa QGene, sede do projeto. As análises serão realizadas pelos softwares testados na Fase 1 e serão desenvolvidas ferramentas de bioinformática para paralelização dessas análises bem como a atualização contínua dos bancos de dados utilizados para os alinhamentos, resultando assim na redução do tempo necessário para esta etapa do processo. A aplicação da tecnologia aqui descrita nos permitiu delinear dois produtos: 16S_ID para identificação bacteriana utilizando a metodologia de sequenciamento NGS da região 16S rRNA; e Microb_ID para a identificação de qualquer microrganismo, genes de resistência aos antibióticos, patogenicidade e virulência através do sequenciamento NGS do conteúdo genômico total da amostra. O diagnóstico preciso do agente causador de infecção é um dos passos cruciais para a definição de um tratamento clínico racional e adequado de infecções, sendo o produto Microb_ID capaz de identificar e caracterizar todos os microrganismos (bactérias, fungos, protozoários e vírus), proporcionando um fluxo de trabalho laboratorial simplificado e objetivo. O mesmo experimento pode fornecer informações sobre a resistência a antibióticos, virulência e origem do agente infeccioso. Assim, o estabelecimento de um diagnóstico e tratamento mais preciso levará a redução da permanência hospitalar e ao uso racional de antibióticos beneficiando o paciente e reduzindo os custos aos sistemas de saúde. (AU)