Laser de baixa potência (lbp) na resolução dos processos inflamatório e fibrótico via modulação e diferenciação de macrófagos renais.

Resumo

A Doença Renal Crônica (DRC) apresenta elevada mortalidade, complicações cardiovasculares e contribuem com mais de 50% de todas as causas de morte nessa população. Mais de 80% desses pacientes têm seu tratamento subsidiado pelo Sistema Único de Saúde (SUS), dentre esses pacientes 15% vão a óbito na fila de espera por um órgão. No Brasil, sua incidência e prevalência estão aumentando, o prognóstico permanece ruim e os custos do tratamento da doença são altíssimos. A DRC induz uma infiltração celular para o rim, principalmente de macrófagos, que produzem fatores de crescimento e citocinas, que induzem a apoptose e a proliferação das células tubulares, o que favorece a ativação e proliferação de fibroblastos. Os macrófagos podem adotar vários fenótipos que levem ao paradigma M1 e M2 de desenvolvimento, referidos como ativação clássica de macrófagos (macrófagos M1), ou ativação alternativa de macrófagos (macrófagos M2). Dependendo do estado de ativação dos macrófagos, eles podem ter importante papel na inflamação e regeneração renal. Macrófagos M2 liberam moléculas antiinflamatórias e fatores de crescimento que diminuem a inflamação renal e promovem a regeneração. Neste sentido, a busca por ferramentas terapêuticas eficazes, de baixo custo, sem efeitos colaterais é idealizada por diversos grupos de pesquisa. Neste projeto, intencionamos demonstrar que o laser de baixa potência (LBP) se encaixa como ferramenta relevante para retardar a progressão da DRC. Serão utilizados camundongos C57BL/6, CX3CR1-GFP e CCR2-RFP, machos, pesando em torno de 20 gramas, fornecidos pelo Biotério da Universidade Federal de São Paulo. Os animais serão mantidos no biotério de camundongos no Departamento de Nefrologia da Universidade Federal de São Paulo, acondicionados em gaiolas coletivas, contendo no máximo cinco animais, com ciclo artificial claro/escuro de 12 horas, a uma temperatura ambiente constante de 22º C e com suprimentos de água e alimento disponíveis todo o tempo. No dia 0, a UUO será realizada por ligação completa do ureter com linha cirúrgica de seda 4-0 em dois pontos, e será feita uma incisão entre os pontos de ligação. Para cada grupo de experimento serão utilizados 10 animais, sendo 5 camundongos submetidos a UUO e 5 controles sem cirurgia. Os animais serão sacrificados com 1, 4 e 7 dias depois da cirurgia. O LBP (TF Premier, MMOptics, São Carlos-SP-Brasil) será aplicado imediatamente após a cirurgia para o grupo de 1 dia, de forma não invasiva na densidade de potência de 150mW, 30 segundos. No grupo de 4 dias os animais serão tratados 1x ao dia todos os dias, e o grupo de 7 dias, os animais serão tratados a partir do terceiro dia de UUO, com a mesma dose citada anteriormente. Os macrófagos renais serão investigados por citometria de fluxo (F4/80, CD11b, Cx3CR1, CCR2, CD86, CD206, MHC classe II, p40IL12 e IL10) e imagem confocal. O perfil M1 e M2 será inferido pelas medidas gênicas e protéicas de moléculas relacionadas (iNOS, CD206, Arginase 1, CXCL9, CXCL10, entre outras). A função renal será aferida por cretinina e albuminuria, enquanto a fibrose renal por medidas de analise de deposição de colágeno I/IV (PCR, WB e picrosirus). A inflamação será estudada por medidas de expressão gênica e proteica (IL6, TNF-±, IL-1², IL10 e IL13). O estudo específico dos macrófagos será feito por transferência adotiva em animais vazios, previamente depletados de macrófagos por uso do lipossomo de clodronato. LBP também será aplicado em macrófagos in vitro antes da transferência (durante 30 segundos, 150 mW de potência, durante 2 dias). Acreditamos que o LBP irá induzir uma expressão rápida de moléculas antiinflamatórias, associadas a um perfil M2 de macrófagos e menos fibrose renal.