Estudo do impacto da função de eIF5A no perfil proteômico celular utilizando o modelo de Saccharomyces cerevisiae

Resumo

O fator de início de tradução 5A (eIF5A) é altamente conservado em arqueas e eucariotos e essencial para a viabilidade celular. eIF5A sofre uma modificação pós-traducional exclusiva e essencial para sua função, em que um resíduo de lisina é convertido em uma hipusina.. O homólogo funcional de eIF5A em bactérias é o fator EF-P, que também sofre modificação dos tipos lisil-lisilação ou arginil-raminosilação em diferentes espécies. Os domínios N e C terminal de eIF5A são sobreponíveis aos domínios I e II de EF-P e o posicionamento da alça de modificação também são conservados. O cristal de EF-P ligado ao ribossomo 70S mostrou que este fator ocupa um local entre os sítios P e E, e mostra a alça de modificação de EF-P posicionada próxima ao centro de peptidil-transferase do ribossomo. Utilizando clivagem de rRNA e tRNA por radical hidroxil, foi modelada a localização de eIF5A no 80S e os dados obtidos sugerem uma ligação de maneira coincidente a EF-P. Estes dados estruturais sugerem uma função de EF-P/eIF5A na formação de ligação peptídica em uma condição em que o sítio E não esteja ocupado pelo tRNA desacilado, uma vez que o local de ligação de eIF5A tem uma sobreposição com o sítio E. Apesar de tanto eIF5A como EF-P já terem sido relacionados com o início da tradução, uma quantidade crescente de estudos mais recentes têm estabelecido sua função na etapa de elongação da tradução, mais especificamente na elongação de sequências contendo prolinas subsequentes (poli-P), as quais são capazes de induzir um stalling (atraso ou parada) do ribossomo devido à baixa reatividade da prolina para formação de ligação peptídica. No entanto, diferentes trabalhos de perfil proteômico celular buscando as proteínas que têm sua tradução dependente de EF-P chegaram à conclusão que não apenas polipeptíeos possuindo poli-P são afetados pela ausência deste fator e que nem todos polipeptídeos poli-P estão diminuídos na ausência de EF-P. Uma análise integrando dados de diferentes estudos levou à conclusão que resíduos logo antes e logo depois de resíduos consecutivos de prolina influenciam a indução de stalling ribossomal e que a taxa de início de tradução e o posicionamento da sequência poli-P em relação à janela aberta de leitura também afetam o grau de dependência de EF-P para a tradução de uma proteína. Por outro lado, existem ainda poucos trabalhos realizados com perfil proteômico na ausência de função de eIF5A, de maneira que atualmente pouco se sabe sobre as proteínas que têm sua tradução dependente de eIF5A. Além disso, eIF5A está relacionado com proliferação celular em diferentes organismos estudados, mais especificamente na transição G1/S, e de diferentes tipos de tumores humanos, o que reforça um papel de eIF5A na tradução de proteínas relacionadas a estas funções. Desta forma, o presente projeto visa a busca de proteínas que têm sua tradução dependente de eIF5A através da comparação de perfil proteômico entre linhagens selvagens e mutantes de eIF5A em Saccharomyces cerevisiae. Para isto, propomos duas estratégias: 1- definição do perfil proteômico por espectrometria de massas (LC-MS/MS) utilizando Stable Isotope Labeling by Amino acids in Cell culture (SILAC) para correlação quantitativa diferencial entre amostras de selvagem e mutante de eIF5A; e 2- definição do perfil proteômico por fluorescência de GFP utilizando uma coleção de 4.156 linhagens, cada uma contendo uma ORF diferente em fusão com GFP no C-terminal, e uma proteína RFP constitutivamente produzida como normalizador, tanto no background selvagem como mutante para eIF5A. Ambos ensaios serão realizados em colaboração com pesquisadores da University of Toronto (Dr. Willian W. Navarre e Dra. Brenda Andrews) e da University of British Columbia (Dr. Leonard J. Foster), especialistas nestes assuntos. Desta forma, será possível contribuir de maneira importante para compreender quais proteínas têm sua tradução dependente de eIF5A e quais são os determinantes desta dependência.