Identificação e caracterização da atividade de fosfolipase A2 independente de Ca2 (aiPLA2) de três peroxirredoxinas do fungo patógeno humano Aspergillus fumigatus

Resumo

Peroxirredoxinas (Prxs) são peroxidases dependentes de tiól que contém um (1-Cys Prx) ou dois (2-Cys Prx) resíduos de Cys envolvidos na catálise. Até o momento, todas as Prxs caracterizadas possuem um motivo universal PxxxT/SxxC e podem reduzir hidroperóxidos com altas taxas (k 106 a 108 M-1 s-1). Apesar de constituírem uma família heterogênea, todas as Prxs possuem atividade peroxidásica dependente da tríade catalítica Thr-Cys-Arg. Já foi descrito para enzimas de mamíferos pertencentes a subfamília Prx6 uma atividade adicional de fosfolipase A2 Ca2+-independente (aiPLA2), dependente da tríade catalítica Ser-Asp-His. Esta atividade está relacionada com o metabolismo de surfactante pulmonar e remodelamento de membranas e com atividade máxima em pH ácido, compatível com a localização lisossomal. Aspergillus fumigatus é um fungo patógeno humano que possui três Prxs pertencentes a subfamília Prx6 (AfPrxA, AfPrxB e AfPrxC). Mostramos previamente que estas Prxs possuem alta atividade peroxidásica com H2O2 (107 M-1 s-1). Na presente proposta BEPE buscamos verificar se estas três Prx de A. fumigatus possuem atividade adicional de aiPLA2. Análises in silico sugerem que AfPrxB e AfPrxC possuem a tríade catalítica relacionada com esta atividade. Adicionalmente, estas enzimas também possuem o peptídeo endereçador lisossomal muito conservado se comparado com o previamente determinado para Prx6 de mamífero. A atividade de aiPLA2 será medida com as proteínas recombinantes purificadas e incubadas com lipossomos contendo fosfolipídeos radioativos, em um tampão livre de Ca2+. Adicionalmente, desejamos investigar esta atividade em extratos celulares de A. fumigatus utilizando diferentes tipos de inibidores e investigar o papel da Ser catalítica (aiPLA2) e da Cys catalítica (atividade peroxidásica) através de mutações sítio-dirigidas. Desta forma, a identificação e caracterização da atividade de aiPLA2 pode auxiliar na compreensão dos papéis fisiológicos destas três enzimas. (AU)