Clonagem, expressão e purificação de uma proteína quimérica construída com base em proteínas de Rhipicephalus microplus

Resumo

O carrapato R. microplus é considerado o parasita de maior importância veterinária nas regiões tropicais e subtropicais do mundo, sendo responsável por grandes perdas na produção de couro, leite e carne, além de atuar como vetor da Babesia sp e de Anaplasma sp, que comprometem ainda mais os bovinos. Até o momento a forma de controle mais utilizada são os acaricidas, entretanto seu uso indevido pode resultar na contaminação do ambiente e dos derivados de bovinos bem como na seleção das linhagens resistentes, o que justifica os esforços empregados na busca de métodos alternativos de controle que resultou no desenvolvimento de duas vacinas comercialmente disponíveis. Entretanto, tais vacinas apresentaram baixos índices de proteção nos rebanhos nacionais, ressaltando a necessidade de estudos bioquímicos de populações brasileiras de R. microplus. Nos últimos anos nosso grupo demonstrou a importância dos inibidores de proteases para a fisiologia de vetores hematófagos e experimentos de vacinação de bovinos com inibidores do tipo Kunitz resultou em uma eficácia de 72% enquanto que a vacinação com apenas um inibidor apresentou uma eficácia de 32%. Com o objetivo de encontrar possíveis alvos para o desenvolvimento de vacinas foi realizado um transcriptoma de intestino de fêmeas ingurgitadas de R. microplus no qual foram observados dois grupos de transcritos majoritários, inibidores de proteases do tipo TIL e moléculas semelhantes a microplusina, uma proteína com atividade antimicrobiana. Com base nessas informações foi realizada a construção de uma proteína quimérica contendo o BmSI, um inibidor do tipo TIL, uma segunda molécula denominada RmSEI, semelhante a microplusina, interligadas por um loop encontrado em um dos transcritos de inibidores de serinoproteases do tipo Kunitz. A quimera foi clonada e expressa em sistema de bactéria utilizando o vetor pET14b e a cepa de bactéria E. coli BL21 plysS entretanto foram observados baixos níveis de expressão da proteína recombinante. Desta forma os objetivos deste projeto são a clonagem, expressão e purificação da quimera em sistema de levedura utilizando Pichia pastoris, e a utilização desta proteína recombinante em ensaios de vacinação de bovinos. (AU)