Estudos funcionais da proteína KIS e investigação de sua participação na leucemogênese

Resumo

KIS é uma serina/treonina quinase que acopla ambas funções de controlar o ciclo celular e a atividade de fatores de splicing. Através de seu domínio UHM, KIS interage com os fatores de splicing SF1 e SF3b1 e através de sua atividade quinase, fosforila estes fatores. Desta forma propõe-se que a função de KIS esteja relacionada ao controle de splicing de RNA. A análise do genoma e exoma de pacientes com neoplasias hematológicas demonstrou mutações somáticas em diversos componentes da maquinaria de splicing, sugerindo que este processo constitui um novo e importante mecanismo na leucemogênese. Um mecanismo de fundamental importância na regulação do splicing é a fosforilação das proteínas envolvidas neste processo. A fosforilação de fatores de splicing viabiliza a interação destes fatores com outras proteínas e com RNA, assim como na sua localização intracelular e sua atividade no splicing alternativo. Níveis elevados de KIS foram observados em amostras de pacientes com leucemia e síndrome mielodisplásica. Nossa hipótese é que a expressão aumentada de KIS pode levar a fosforilação excessiva de seus substratos (no caso, SF1 e/ou SF3b) podendo assim contribuir para o processo leucemogênico. Assim, o objetivo deste trabalho é de investigar o papel de KIS na leucemogênese através do modelo murino de transplante de medula óssea. A realização desta pesquisa justifica-se pois será de valorosa contribuição para definir o papel de KIS na leucemogênese e sua implicação como um potencial alvo molecular para desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas alvo-específicas. A metodologia se baseia na construção de um vetor retroviral (MIY-KIS; MIY= MSCV (Murine Stem Cells Virus) + IRES (Internal Ribosome Entry Site) + YFP (Yellow Fluorescent Protein)) para a superexpressão de KIS, que será utilizado para transfecção em células de empacotamento 293 Phoenix, nas quais ocorrerá a produção de partículas virais que infectarão as células de empacotamento de origem murina GP+E86. As células GP+E86 eficientemente transduzidas serão separadas por FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting) e após serão submetidas a single sorting para a produção de populações monoclonais produtoras estáveis de retrovírus. A mais estável dessas populações será cultivada juntamente com células progenitoras hematopoiéticas obtidas da medula óssea de camundongos, para que ocorra transdução. As células transduzidas serão transplantadas, por via intravenosa, na medula óssea de camundongo. Os animais serão observados por até 12 meses à procura do desenvolvimento de leucemia. Aqueles que desenvolverem a doença, serão sacrificados e será realizada análise de células da medula óssea e do baço. Também serão realizados ensaios de formação de colônia (Colony Forming Cell Assay - CFC), com o objetivo de analisar a habilidade transformante de KIS superexpresso possui nas células progenitoras. Para analisar essa mesma habilidade nas células-tronco hematopoiéticas mais primitivas, células progenitoras transduzidas (com MIY-KIS e MIYvazio) e purificadas serão injetadas em animal letalmente irradiado e a formação de colônias no baço será avaliada após 12 dias. Será realizada, ainda, análise do padrão de fosforilação dos fatores de splicing SF1 e SF3b1 em células tronco hematopoiéticas que superexpressam KIS através de eletroforese 2D, assim como será analisado o padrão de splicing global dessas células utilizando RNAseq. (AU)