O efeito da super-expressão de Trx-1 na expressão proteica e no estado redox de cisteínas pela marcação com iodoTMT e TMT

Resumo

ADAM17 é uma metaloproteinase da membrana que tem a função principal de modular eventos de sinalização da superfície celular através da libertação ectodomínios de proteínas de superfície tornando-os solúveis para interagir com receptores celulares. O sistema tiorredoxina é o maior sistema dissulfeto redutase, essencial para a síntese de DNA e defesa contra estresse oxidativo. Vários estudos mostram a modulação da atividade de ADAM17 e nosso grupo identificou Trx-1 como parceiro de interação de ADAM17. Uma das nossas descobertas mais recentes é que ADAM17 favorece a forma monomérica da Trx-1 e isso parece estar associado com sua atividade. A constante e crescente necessidade por métodos de medidas de quantidades relativas de proteínas, permitiu a introdução de diferentes estratégias que envolvem marcação isotópica como iodoTMT e TMT. Os reagentes iodoTMT são um conjunto isobárico (massa e estrutura) e isômeros que são covalentemente iodoacetil-ativados, marcados irreversivelmente para grupos sulfidril (-SH). Semelhante à iodoacetamida, os reagentes iodoTMT reagem especificamente com cisteínas reduzidas em peptídeos e proteínas a serem diferenciados por espectrometria de massa, possibilitando a quantificação da abundância relativa de modificações de cisteínas, tais como a S-nitrosilação, oxidação e pontes dissulfeto, em células de cultura tratadas com diferentes condições. A marcação isobárica, como TMT, é acessada através de tags que são idênticas em massa, de modo que todos os peptídeos derivatizados são isobáricos e cromatograficamente indistinguíveis, obtendo-se um único pico no espectro de massa para ambas as amostras (controles e tratadas). No entanto, a abundância relativa dos peptídeos marcados isobaricamente é revelada quando a porção do fragmento do íon repórter com massas diferentes é liberada no MS/MS. O TMT contém grupos reativo, normalizador e repórter. Como um dos nossos resultados é de que a forma monomérica de Trx-1 por ADAM17 parece estar associada à atividade de Trx-1, o objetivo deste projeto é analisar o estado redox de cisteínas totais em lisado celular por iodoTMT e a expressão de proteína total por TMT com Trx-1 e o domínio citoplasmático mutante e wild type de ADAM17.