Avaliação da bioenergética mitocondrial e estresse oxidativo em células prostáticas humanas tratadas com ácido docosahexaenóico e melatonina

Resumo

A próstata é uma glândula regulada por esteroides sexuais e a influência de fatores exógenos, como a dieta, ainda não está elucidada. Estudos indicam que, além da quantidade, a qualidade dos lipídios pode influenciar a homeostase intracelular promovendo a carcinogênese. Além disso, células tumorais prostáticas têm seu metabolismo energético alterado com preferência pela oxidação de ácidos graxos em detrimento da via glicolítica. O ácido docosahexaenóico (DHA) é um ácido graxo polinsaturado É-3 (PUFA) essencial e sua relação com o câncer de próstata ainda é controversa. Isto porque estudos mostram uma significativa concentração de DHA em tumores de próstata, enquanto outros têm investigado seu potencial terapêutico por aumentar o estresse oxidativo pela via mitocondrial e levar à morte celular. Entretanto, sua ingestão também ocorre em condições normais pela dieta e os efeitos do DHA em células prostáticas não transformadas podem envolver mecanismos que alteram a biologia da glândula. A melatonina é um hormônio produzido pela glândula pineal que detém propriedades antimitogênicas, antioxidantes e parece interferir no aporte de ácidos graxos na célula. Esta indolamina pode atravessar a membrana plasmática e atuar diretamente sobre espécies reativas de oxigênio, como também influenciar positivamente a fisiologia mitocondrial. Tendo este panorama, o objetivo deste trabalho é determinar se o DHA afeta a proliferação e sobrevivência de células humanas prostáticas normais, a homeostasia mitocondrial e por quais mecanismos, bem como a participação da melatonina nesses processos. A linhagem PTNA1 será estudada em condição normal (C), com melatonina (M), com DHA (DHA) e ambos (DHA+M). Primeiramente será determinada a concentração de DHA que afeta o estado redox intracelular. Em seguida serão testadas dosagens fisiológicas, suprafisiológicas e farmacológicas de melatonina para o estudo da sua propriedade antioxidante frente ao DHA, sendo o luzindol utilizado como antagonista dos receptores de membrana MT1 e MT2. Estas padronizações serão monitoradas pelos testes viabilidade por exclusão com Trypan Blue, proliferação celular por MTT e pela razão GSH/GSSG. Os níveis intracelulares de melatonina serão determinados por HPLC-UV. O consumo de oxigênio e da atividade dos complexos respiratórios serão determinados em mitocôndrias isoladas em oxígrafo e o potencial de membrana mitocondrial pelo método da safranina O. Os níveis de peróxido de hidrogênio serão mensurados pelo método com Amplex Red e o radical superóxido pelo ensaio com MitoSOX, ambos em espectrofotômetro de fluorescência. O perfil antioxidante será determinado por ensaios bioquímicos para atividade da Catalase, Glutationa peroxidase, Superóxido desmutase e Glutationa-S-transferase. A lipoperoxidação será estimada pelos níveis de MDA. A avaliação da via de sobrevivência celular será feita por Western Blotting para AKT, pAKT, mTOR e pmTOR. Esta técnica também será aplicada para análise de receptores MT1 na fração mitocondrial. O exame ultraestrutural será realizado por microscopia eletrônica de transmissão em cortes ultrafinos em historesina. Desta forma, este estudo fornecerá melhor compreensão dos mecanismos envolvidos na sobrevivência de células prostáticas frente aos PUFAs e ao tratamento com MLT. (AU)