Efeitos de variantes da proteína LMP1 do vírus de Epstein-Barr na regulação da transição Epitelial-Mesenquimal em células epiteliais humanas in vitro

Resumo

Estima-se que pelo menos 15% de todos os cânceres diagnosticados estejam relacionados a infecção por agentes infecciosos, incluindo vírus cancerígenos. O vírus de Epstein Barr (EBV) é um herpevírus gama descoberto em 1964, sendo o primeiro vírus cancerígeno descrito para humanos. O contágio se dá por meio da saliva e mais de 90% da população adulta apresenta infecção latente pelo EBV, que está etiologicamente relacionado ao desenvolvimento da mononucleose infecciosa, do linfoma de Burkitt endêmico e o carcinoma indiferenciado de nasofaringe, dentre outras doenças. O principal produto oncogênico do EBV é a proteína latente de membrana 1 (LMP1), que interfere em diversas vias intracelulares de sinalização, favorecendo a imortalização e proliferação celular, o que ocasionalmente culmina com o desenvolvimento de câncer. O presente estudo visa analisar as propriedades das variantes de LMP1 derivadas dos genótipos virais B95.8 e M81 na regulação do programa de transição epitelial-mesenquimal (EMT), fenômeno crucial na progressão de carcinomas. Para tanto será gerado modelo in vitro de células epiteliais expressando as variantes B95.8 e M81 de LMP1 a fim de se discriminar os efeitos de LMP1 na regulação da EMT e em vias de sinalização intracelular relevantes para migração e invasão celular. Para tanto serão empregadas técnicas de DNA recombinante para produção de vetores para expressão de LMP-1 B95.8 e M91, os quais serão utilizados para transfectar células SW480 (adenocarcinoma coloretal humano) e NP69SV40T (células epiteliais de nasofaringe). As células expressando LMP1 serão submetidas à extração de RNA, total, o qual será convertido em cDNA e analisado, por meio de Reação em Cadeia da Polimerase quantitativa em tempo real (qPCR), quanto à expressão em nível transcricional de genes selecionados que codificam fatores de transcrição indutores de EMT (Snail, Slug, Twist e ZEB1), marcadores de fenótipos epitelial (Caderina E, ZO-1) e mesenquimal (Caderina N, vimentina, ±-SMA, fibronectina, metaloproteinases 2 e 9) e proteínas de sinalização intracelular envolvidos na regulação da EMT (PI3K p85a, AKT, PTEN, FAK, Src, IºB±, NFºB p65, e STAT3). A depender dos resultados de expressão diferencial obtidos, a expressão dos genes selecionados será contravalidada em nível proteico para alvos específicos empregando western blotting. Ao final dos experimentos espera-se encontrar dados sobre eventuais diferenças nos efeitos das variantes B95.8 e M81 na expressão de genes envolvidos na EMT e em componentes de vias intracelulares relacionadas a esse fenômeno que tem papel importante na agressividade biológica de carcinomas.