Análise comparativa de biguanida e diamidina associadas a inibidores enzimáticos na viabilidade celular de células da córnea e trofozoítos de Acanthamoeba spp

Resumo

Amebas de vida livre do gênero Acanthamoeba estão diretamente relacionadas às infecções do epitélio corneano. Em geral, a infecção na superfície da córnea pelo protozoário, denominada ceratite amebiana, acomete indivíduos jovens e sadios e o aumento exponencial do número de casos de ceratites por Acanthamoeba spp tem despertado a curiosidade científica mundial, bem como a atenção dos órgãos de saúde competentes. O trauma prévio na superfície da córnea associado a higiene e/ ou uso inadequados de lentes de contato são os principais fatores de risco da ceratite amebiana. A adesão inicial de Acanthamoeba spp ao epitélio da córnea é precedida pela secreção de diferentes enzimas proteolíticas pelo protozoário, que induzem a migração de macrófagos e neutrófilos para o sítio infeccioso, resultando no estabelecimento de um processo inflamatório intenso. Neste sentido, a terapêutica está baseada principalmente na utilização tópica de compostos químicos (para inativação de cistos e/ ou trofozoítos de Acanthamoeba spp), como biguanidas e diamidinas, associados a corticosteróides (bloqueadores enzimáticos de metalo proteinases provenientes da degranulação neutrofílica). No entanto, a utilização destes medicamentos em altas concentrações e por longo período de tempo (~ 4-6 meses) pode induzir o desenvolvimento de catarata progressiva e atrofia de íris. Além disso, a possibilidade do uso de corticosteróides auxiliar não somente na imunossupressão do paciente, mas também no desencistamento e proliferação de trofozoítos de Acanthamoeba spp é outro aspecto relevante a ser considerado no aumento da severidade clínica. Por estes motivos, a ausência de protocolo padronizado quanto ao agente antimicrobiano, concentração e tempo de uso têm sido considerados como principais fatores limitantes para o sucesso terapêutico. Assim, este projeto de pesquisa propõe alcançar os seguintes objetivos: avaliar a menor concentração de biguanida e diamidina efetiva para inativação de cistos e/ ou trofozoítos de Acanthamoeba spp e os possíveis efeitos tóxicos em células da córnea; estudar a associação dos agentes antimicrobianos com diferentes inibidores enzimáticos das toxinas secretadas pelo protozoário na inativação de cistos e/ ou trofozoítos de Acanthamoeba spp e os possíveis efeitos tóxicos em células da córnea; correlacionar as análises experimentais anteriores com estudos de interação do protozoário e células da córnea na presença dos agentes antimicrobianos e diferentes inibidores enzimáticos. A partir da concentração de uso na rotina clínica, será estudada por diluição seriada, a ação dos seguintes compostos na viabilidade celular de Acanthamoeba spp, bem como o respectivo efeito tóxico nas células da córnea: polihexametil biguanida a 0.02%, isotionato de propamidina a 0.1% e diisotionato de hexamidina a 0.1%. Os agentes antimicrobianos serão associados a diferentes inibidores enzimáticos, tais como PMSF, aprotinina e EDTA. As linhagens SIRC (fibroblasto de córnea de coelho) e HCEC (célula epitelial da córnea humana) serão utilizadas como modelo celular de mamíferos. Serão realizadas análises qualitativas e quantitativas, em triplicata, de cada experimento e os resultados serão comparados e tratados estatisticamente. A partir da implementação do estudo, são esperados resultados que auxiliem (1) no estabelecimento de padrão terapêutico específico para ceratite amebiana, de forma a minimizar possíveis efeitos citotóxicos da biguanida e das diamidinas sobre o epitélio saudável da córnea do hospedeiro; (2) na compreensão do efeito dos inibidores enzimáticos sobre a viabilidade de células da córnea; (3) propor, a partir dos resultados obtidos, o escalonamento dos experimentos para o modelo animal e (4) proporcionar perspectivas de melhorias qualitativas ao paciente portador de ceratite amebiana, minimizando a dor associada à infecção e as possíveis complicações pós-terapêuticas.