Geração de camundongos geneticamente deficientes usando a tecnologia de edição gênica CRISPR/Cas

Resumo

A autofagia é um processo de degradação celular que captura e degrada organelas e patógenos intracelulares em estruturas chamadas autolisossomos. A função da autofagia durante a infecção por Trypanosoma cruzi permanece incerta. Durante o desenvolvimento do projeto de doutorado demonstramos que a autofagia é induzida em resposta à T. cruzi favorecendo o controle da replicação parasitária em macrófagos. Além disso, demonstramos que múltiplos receptores de reconhecimento padrão (PRRs) assim como a produção de óxido nítrico (NO) são requeridos para a indução de autofagia por T. cruzi. Neste contexto, pretendemos determinar os mecanismos moleculares envolvidos na indução de autofagia mediada por NO. Para este fim, utilizamos a espectrometria de massa para identificar novas proteínas que podem ser especificamente reguladas por NO em resposta à infecção por T. cruzi. A próxima e importante etapa do projeto é validar as proteínas candidatas gerando macrófagos com deficiência nos genes alvos através da tecnologia de edição gênica CRISPR/Cas (clustered regularly interspaced repeats - Cas associated). Essa metodologia é amplamente utilizada para realizar a edição de genes em células eucarióticas e organismos em curto espaço de tempo, mas só recentemente foi usada para gerar camundongos deficientes em genes específicos. O sistema utiliza um RNA guia (sgRNA) para dirigir a endonuclease Cas9 para praticamente qualquer lugar do genoma. Após, Cas9 gera quebras na dupla fita de DNA (DSBs) e facilita a reparação ou a inserção de mutações. Neste projeto, buscamos o treinamento da bolsista para realização da tecnologia CRISPR/Cas com o intuito de abordar questões essenciais relacionadas aos mecanismos envolvidos na restrição da replicação parasitária mediada por NO / autofagia. O desenvolvimento deste projeto facilitará a compreensão da resposta imune do hospedeiro mediada por NO e autofagia. Além disso, será essencial na formação de um indivíduo que poderá estabelecer esta técnica no Brasil, favorecendo assim o desenvolvimento científico da comunidade científica no estado de São Paulo. Dessa forma, decidimos aprender e desenvolver a tecnologia CRISPR/Cas no laboratório do prof. Hidde Ploegh que trabalha em colaboração com o laboratório do prof. Rudolf Jaeninisch. Ambos os grupos pertencem ao Instituto Whitehead em Cambridge, Massachusetts, sendo os pioneiros em gerar camundongos com deficiência em genes por CRISPR. Esses laboratórios são totalmente eficientes em realizar transferência nuclear em células somáticas e edição gênica em camundongos por CRISPR e mostraram grande entusiasmo em colaborar com nosso grupo para implementação da técnica no Brasil. (AU)