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Caracterização funcional, estrutural e modificação racional da ASPaseM: um novo fármaco para o tratamento da anemia linfóide aguda?

Processo: 14/22039-9
Modalidade de apoio:Bolsas no Brasil - Doutorado Direto
Vigência (Início): 01 de março de 2015
Vigência (Término): 30 de abril de 2019
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Bioquímica - Biologia Molecular
Pesquisador responsável:Marcos Antonio de Oliveira
Beneficiário:Leonardo Schultz da Silva
Instituição Sede: Instituto de Biociências (IB-CLP). Universidade Estadual Paulista (UNESP). Campus Experimental do Litoral Paulista. São Vicente , SP, Brasil
Vinculado ao auxílio:13/08617-7 - Produção de L-asparaginase extracelular: da bioprospecção à engenharia de um biofármaco antileucêmico, AP.TEM
Bolsa(s) vinculada(s):18/04685-1 - Diversidade biológica de ASNAses: avaliação da evolução das enzimas e determinação da estrutura cristalográfica de ASNaseM, BE.EP.DD
Assunto(s):Anemia   Leucemia-linfoma linfoblástico de células precursoras   Asparaginase
Palavra(s)-Chave do Pesquisador:L-asparaginase | Leucemia linfoblástica aguda | Estrutural

Resumo

L-asparaginases (L-ASPases) bacterianas são importantes biofármacos utilizados no tratamento de Leucemia Linfóide Aguda (LLA), uma vez que este tipo tumoral é dependente da disponibilidade de asparagina (Asn) extracelular. As L-ASPases bacterianas são capazes de hidrolisar eficientemente Asn em ácido aspártico (Asp) e amônia (NH3), diminuindo a disponibilidade de Asn para células tumorais e induzindo apoptose. Apesar de aparentar ser uma alternativa, as isoformas humanas não podem ser utilizadas no tratamento da LLA uma vez que o Km reside na faixa de milimolar, enquanto que as enzimas bacterianas apresentam Km ~7.5 × 10-6 M. Comercialmente, indústrias farmacêuticas internacionais produzem L-ASPases de Eschericchia coli e Erwinia chrysantemi, mas esse biofármaco não é produzido pelas indústrias farmacêuticas brasileiras. Neste contexto, fontes alternativas desta enzima e auto-suficiência em sua produção são importantes para evitar falhas no tratamento devido a flutuações internacionais de sua fabricação. Neste trabalho, temos como objetivo a caracterização de uma nova L-ASPase, denominada de ASPaseM que compartilha elevada homologia (> 30% de identidade e 40% de similaridade) com as enzimas bacterianas utilizadas no tratamento da LLA e que possui todos os aminoácidos envolvidos na catálise conservados, sugerindo uma fonte alternativa potencial para o tratamento da LLA. Temos como metas a caracterização estrutural por meio de cristalografia de raios-X de ASPaseM, bem como no engenheiramento da enzima visando melhorar suas características físico-químicas e farmacológicas. Inicialmente, serão padronizadas metodologias para sua expressão e purificação, ensaios funcionais de atividade enzimática para determinação dos parâmetros cinéticos da atividade de asparaginase e glutaminase e sua caracterização estrutural por meio de metodologias envolvendo espectroscopia de dicroísmo circular (CD), espalhamento dinâmico de luz (DLS), espalhamento de raios-X em baixo ângulo (SAXS) e cromatografia de exclusão molecular (SEC). Adicionalmente, serão realizadas abordagens de Engenharia Racional de proteínas com base na estrutura cristalográfica e mutações sítio dirigidas com o objetivo de produzir uma L-ASPase com características mais apropriadas para terapias, com acentuada atividade catalítica de asparaginase e atividade reduzida de L-glutaminase, mais estáveis e mais resistentes a proteólise em razão de maior empacotamento ou deleção de sítios proteolíticos. Durante todo o projeto será efetuada a cristalização de ASPaseM (e mutantes de interesse) e também a co-cristalização com ligantes (Asp, Glu ou succninato) visando a determinação de estruturas cristalográficas de ASPaseM ou mutantes, com ou sem ligantes no sítio ativo, visando um maior entendimento de aspectos funcionais. Adicionalmente, tanto ASPaseM quanto outras variantes carreando substituições de aminoácidos terão sua atividade antitumoral testada em células monocíticas REH provenientes de leucemia linfoblástica aguda (ATCCCRL-8286). O corrente projeto já conta com dados preliminares e estão apresentados no final da proposta. (AU)

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Publicações científicas
(Referências obtidas automaticamente do Web of Science e do SciELO, por meio da informação sobre o financiamento pela FAPESP e o número do processo correspondente, incluída na publicação pelos autores)
DE MOURA, WERNER ALFINITO FEIO; SCHULTZ, LEONARDO; BREYER, CARLOS ALEXANDRE; DE OLIVEIRA, ANA LAURA PIRES; TAIRUM, CARLOS ABRUNHOSA; FERNANDES, GABRIELLA COSTA; TOYAMA, MARCOS HIKARI; PESSOA-JR, ADALBERTO; MONTEIRO, GISELE; DE OLIVEIRA, MARCOS ANTONIO. Functional and structural evaluation of the antileukaemic enzymel-asparaginase II expressed at low temperature by differentEscherichia colistrains. Biotechnology Letters, . (13/08617-7, 17/19942-7, 17/25272-4, 19/04054-4, 14/22039-9, 16/19245-1, 17/20291-0, 11/13500-6)
DA SILVA, LEONARDO SCHULTZ; DOONAN, LIAM B.; PESSOA, JR., ADALBERTO; DE OLIVEIRA, MARCOS ANTONIO; LONG, PAUL F.. Structural and functional diversity of asparaginases: Overview and recommendations for a revised nomenclature. Biotechnology and Applied Biochemistry, . (18/04685-1, 13/08617-7, 14/22039-9, 17/19942-7)
Publicações acadêmicas
(Referências obtidas automaticamente das Instituições de Ensino e Pesquisa do Estado de São Paulo)
SILVA, Leonardo Schultz da. Caracterização funcional, estrutural e modificação racional da ASNaseM: Um novo fármaco para o tratamento da Leucemia Linfoide Aguda?. 2019. Tese de Doutorado - Universidade Estadual Paulista (Unesp). Instituto de Biociências. São Vicente São Vicente.

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