Identificação de epialelos de metilação de suceptibilidade à fissura lábio-palatina com o uso de amostras de pacientes e modelos de fissura palatina em camundongo

Resumo

As fissuras lábio-palatinas não sindrômicas (FL/P NS) são as malformações craniofaciais mais frequentes ao nascimento, atingindo cerca de 1 a cada 700 nascidos vivos. As FL/P NS são clinicamente variáveis, podendo afetar desde apenas o lábio até o alvéolo dentário e palato, uni ou bilateralmente. Estudos de herdabilidade indicam uma contribuição genética entre 40 e 85% e as FL/P NS tem sido classificadas como doenças complexas e heterogêneas. Apesar da intensa aplicação da abordagem de GWAS (Genome-Wide Association Study) na busca dos fatores genéticos que contribuem para as FL/P NS, os loci encontrados pouco explicam a parcela genética observada. Ao mesmo tempo, estudos epidemiológicos demonstram a associação de fatores relacionados ao baixo status socioeconômico às FL/P NS, evidenciando uma importante contribuição ambiental. Tais dados sugerem que mecanismos alternativos estão possivelmente envolvidos na etiologia das FL/P NS, como, por exemplo, fatores epigenéticos. Com o intuito de melhor identificar os fatores etiológicos das FL/P NS, propomos a investigação de diferenças nos sítios de metilação do DNA, um dos principais mecanismos epigenéticos, entre amostras FL/P NS e controles pela abordagem EWAS (Epigenome-Wide Association Study). Nossa hipótese é que sítios de metilação de DNA atuariam como epialelos (alelos epigenéticos) em genes importantes para o desenvolvimento craniofacial e que diferenças nos seus níveis de metilação predisporiam às FL/P NS. Para testar tal hipótese, como parte do projeto de doutorado em questão, iniciamos a análise de 67 metilomas FL/P NS e 59 metilomas controles (a partir de DNA de sangue periférico), realizados com a plataforma Infinium Human Methylation 450K (Illumina), a fim de identificar regiões diferencialmente metiladas (DMRs) em genes candidatos para as FL/P NS. Os resultados preliminares indicaram uma assinatura epigenética significativamente distinta em amostras FL/P NS, com 1000 DMRs, sendo 28 em genes descritos previamente como candidatos para as FL/P NS e 128 em genes reportados como diferencialmente metilados no desenvolvimento de palato de camundongo. Para gerarmos resultados conclusivos é fundamental expandirmos a amostra, bem como validar em uma segunda amostra de outra população. Assim sendo, a nossa proposta para o BEPE é investigarmos os níveis de metilação das DMRs candidatas em uma amostra FL/P NS expandida (N<500, DNAs de sangue periférico) e validarmos estes resultados não apenas nas amostras de pacientes brasileiros como também de origem europeia (ingleses). Em seguida pretendemos correlacionar com os níveis de metilação e com os seus respectivos níveis de expressão gênica em amostras de tecido muscular de palato coletadas dos mesmos indivíduos em que estudamos metilação em sangue periférico. Para avaliarmos a importância dos epialelos de metilação na etiologia das FL/Ps, também usaremos um modelo animal de fissura, os camundongos mutantes Chd7, que apresentam fissura de palato associada a penetrância de 35 %. Quantificaremos os níveis de metilação das DMRs candidatas em lâminas palatinas de embriões de camundongo mutantes Chd7 penetrantes e não penetrantes, a fim de verificar se as DMRs podem atuar como epialelos moduladores da penetrância do fenótipo. Nesta etapa, também correlacionaremos os níveis de metilação com os níveis de expressão gênica. Se nossas hipóteses forem corroboradas, os dados permitirão que sejam buscados os fatores ambientais e/ou genéticos capazes de agir sobre os epialelos encontrados, além de verificar se tais alterações epigenéticas podem ser herdadas e explicar, ao menos parcialmente, a alta herdabilidade das FL/P NS. (AU)