Identificação de pericitos no ligamento periodontal e sua caracterização como células mesenquimais indiferenciadas

Resumo

Atualmente, há um consenso a respeito da importância biológica da presença de células mesenquimais indiferenciadas (MSCs) na área do defeito periodontal sobre a regeneração dos tecidos periodontais de suporte. Tem sido sugerido que as MSCs estariam localizadas na região perivascular dos diferentes órgãos/tecidos, possuindo características semelhantes aos pericitos, os quais apresentam a capacidade de migrar e proliferar em caso de danos teciduais. Entretanto, não existem evidências concretas mostrando que, as células do ligamento periodontal caracterizadas como mesenquimais indiferenciadas correspondem as mesmas populações celulares identificadas como pericitos. Além disso, não existem evidências a respeito da distribuição destas células nos tecidos periodontais saudáveis e acometidos pela doença periodontal inflamatória crônica. Sendo assim, o presente estudo tem como objetivos: 1) Isolar e caracterizar fenotipicamente as populações de pericitos provenientes do ligamento periodontal de humanos e 2) Avaliar a distribuição dos pericitos/células mesenquimais indiferenciadas nos tecidos periodontais saudável e acometidos pela doença periodontal inflamatória crônica. Para isso, serão selecionados 3 indivíduos adultos com indicação de extração de seus terceiros molares inclusos para a obtenção da cultura primária de células do ligamento periodontal (PDL). A partir das células do PDL, populações de pericitos (células CD146 positivas) serão purificadas, utilizando-se a técnica da separação magnética, e caracterizadas quanto ao fenótipo mesenquimal indiferenciado (expressão dos marcadores CD105, CD166, STRO-1 e OCT-4) e fenótipo endotelial/hematopoiético (expressão dos marcadores CD34 e CD45), empregando as técnicas de citometria de fluxo e imunocitoquímica. Em seguida, será avaliado o potencial das células CD146 positivas para diferenciarem-se em fenótipo osteoblástico e adipogênico, utilizando os ensaios de vermelho de alizarina (formação de nódulos minerais), oil red O (coloração de vacúolos de lipídio) e expressão dos genes RUNX-2, ALP e OCN (marcadores osteoblásticos); e PPAR³2 e LPL (marcadores osteogênicos) pela técnica do PCR quantitativo (PCRq), feito ensaio de imunofluorescência para STRO-1 e OCT-4; e ensaio de mineralização e expressão gênica(real time - PCR). Posteriormente, ligaduras de algodão serão instaladas em 20 ratos machos (Rattusnorvegicus, albinus, Wistar), para indução da doença periodontal. Após o período de 7 e 21 dias de indução da doença, as ligaduras serão removidas e os animais sacrificados. Em seguida, será feito análise histométrica e ensaio de imunohistoquímica para determinar o padrão de distribuição de células CD105+ STRO-1+ CD146+ nos tecidos periodontais saudável e acometido pela doença periodontal inflamatória crônica. (AU)