O papel das lisina(K)-deacetilases na função, dinâmica e degradação mitocondrial, e em modificações pós-traducionais de proteínas alteradas: relevância para a neuroproteção

Resumo

O objetivo desse projeto é caracterizar o papel das Lisina(K)-deacetilases (KDACs) na função, dinâmica e degradação mitocondrial, assim como nas modificações pós-traducionais (acetilação e fosforilação) de proteínas alteradas já que as KDACs, incluindo as clássicas histonas deacetilases (HDACs), são capazes de regular diferentes mecanismos como transcrição gênica, transdução de sinal e metabolismo. Pelo fato das KDACs também possuírem como alvos proteínas da via autofágica, será investigado ainda os níveis de autofagia e mitofagia em modelos celulares distintos da Doença de Huntington (DH) que expressam a proteína huntingtina mutante (mHtt) full-lenght. Embora seja difícil prever a sequencia de eventos celulares danosos que ocorrem nas doenças neurodegenerativas, diversos mecanismos têm sido propostos incluindo a disfunção mitocondrial. As mitocôndrias são organelas sensíveis a fatores de nutrição, agentes tóxicos, proteínas alteradas e a alterações na degradação citoplasmática. Modificações de mecanismos que regulam a fissão-fusão mitocondrial e o seu transporte axonal (dinâmica), biogênese e degradação podem ocorrer em paralelo, promovendo um ao outro, convergindo para a disfunção celular. Além disso, o papel central da mitocôndria no metabolismo celular requer a integração e a coordenação de suas funções com outras organelas, nomeadamente o núcleo. Assim, a função mitocondrial pode ser afetada direta- ou indiretamente por alteração da transcrição em ambos os DNA, DNA mitocondrial (mtDNA) e nuclear (nDNA).Durante o projeto, três modelos serão estudados: neurônios (SH-SY5Y) e astrócitos (1321N1) imortalizados transfectados com a mHtt full-lenght e fibroblastos de pacientes de DH e indivíduos controle. Na tarefa 1, será investigado o papel das KDACs na função mitocondrial. Alterações dos níveis das KDACs, após o tratamento com diferentes inibidores de KDACs (KDACis) ou siRNA para KDACs específicas serão relacionados com a função mitocondrial (potencial de membrana, consumo de oxigênio, e homeostase de cálcio), níveis de espécie reativas de oxigênio (ROS), número de cópias de mtDNA e fissão e fusão mitocondrial, que será investigado com anticorpos contra Fis1, Mfn1, Mfn2, Drp1, PINK1 e Parkin. Além disso, a função mitocondrial será testada quanto a presença da mHtt acetilada e fosforilada. Como contra prova do efeito das KDACis ou siRNA nas modificações pós-traducionais da mHtt, as células serão transfectadas com Ac-mHtt-K444, Ac-mHtt-K444R e P-mHtt-S13/S16/S431, formas da mHtt acetiladas e resistentes a acetilação e fosforilação, respectivamente. Na tarefa 2, será avaliada a influência das KDACs, após tratamento com KDACis ou transfecção com siRNAs, na indução da autofagia e mitofagia. Para isso, serão avaliados por western blot (WB) diversos marcadores dessa via como LC3, LAMP-1 e -2 e autofagossomos, e por fluorescência, com Hoechst, Lysotracker Red e Autophagy LC3B-GFP. Os experimentos também serão realizados após transfecção com Ac-mHtt-K444(R) e P-mHtt-S13/S16/S431. Na tarefa 3, será estudado o impacto das diferentes KDACs na regulação da transcrição de genes autofágicos e metabólicos (relacionados com a mitocôndria). A transcrição será avaliada por PCR-arrays (autofagia, mitocôndria e sinalização do mTOR), além de Real-Time(q)PCR e WB na presença de KDACis, siRNA, mHtt, Ac-mHtt-K444(R) e P-mHtt-S13/S16/S431.Desta forma, espera-se que esse projeto possa contribuir para descobertas de novos mecanismos de neuroproteção envolvendo epigenética e modificações pós-traducionais; os resultados obtidos aqui podem ser potencialmente relevantes para futuros estudos quanto ao papel das KDACs em outras desordens neurodegenerativas e neuropsiquiátricas. (AU)