Análise in vitro da ligação de eIF5A ao ribossomo usando anisotropia de fluorescência: perspectivas dos mutantes de eIF5A do alanina scanning

Resumo

O fator de tradução 5A (eIF5A) é altamente conservado em Arqueas e eucariotos e é essencial para a viabilidade celular. Esta é a única proteína que contém o aminoácido hipusina, essencial para a função de eIF5A, gerado por uma modificação pós-traducional. Embora eIF5A tem sido muito envolvida em diversos processos celulares, apenas recentemente foi determinado um papel para eIF5A na síntese proteica, mais especificamente, na elongação da tradução. Foi sugerido que, durante a elongação da tradução, eIF5A ajuda na formação da ligação peptídica de uma sequência específica de aminoácidos. Para melhorar a descrição e entendimento do mecanismo de eIF5A na tradução, é necessário determinar os pontos de interação entre o ribossomo e eIF5A. Nosso laboratório, em colaboração com o laboratório dos pesquisadores Dr. Christopher S. Fraser e Dr. John W. Hershey, desenvolveu a metodologia de anisotropia de fluorescência para medir a cinética da ligação de eIF5A ao ribossomo. Neste projeto, nos propomos usar a técnica de anisotropia de fluorescência para investigar a cinética de formação do complexo eIF5A-ribossomo de uma série de novos mutantes de eIF5A recentemente gerados em nosso laboratório. Estes novos mutantes de eIF5A foram gerados baseados na estratégia de alanina scanning, para então poder identificar os resíduos importantes para interação física de eIF5A com o ribossomo. Nós geramos 13 janelas mutantes de eIF5A e testou-se a funcionalidade dos mutantes através do ensaio de complementação em levedura. Dos 13 mutantes, 7 não apresentaram diferença no crescimento, 5 revelaram fenótipo sensível a temperatura (ts - temperature sensitive) e 1 não foi capaz de substituir eIF5A selvagem da célula. Portanto, o uso da anisotropia de fluorescência para medir a ligação de eIF5A ao ribossomo irá ajudar a elucidar se os resíduos de aminoácidos escolhidos nessa estratégia de alanina scanning estão diretamente envolvidos no contato físico de eIF5A com o ribossomo. (AU)