Avaliação do método de sequenciamento de nova geração no diagnóstico genético de neoplasia endócrina múltipla tipo 1

Resumo

A neoplasia endócrina múltipla tipo 1 (MEN1) é uma doença genética, de herança autossômica dominante, caracterizada pelo desenvolvimento de tumores endócrinos acometendo, principalmente, hipófise, paratireoide, pâncreas/duodeno endócrinos. É causada, principalmente, por mutação germinativa no gene supressor tumoral MEN1 (11q13). A tumorigênese segue o modelo de Knudson (1971). O diagnóstico genético de famílias com MEN1 reconhece os portadores assintomáticos de mutação MEN1, permite o diagnóstico e tratamento precoce de tumores, promove a redução da morbi-mortalidade relacionada à MEN1 e exclui familiares não portadores de mutação do rastreamento clínico periódico. O diagnóstico genético de MEN1 tem sido realizado por meio da técnica de sequenciamento Sanger. Entretanto, limitações desta técnica a tornam menos custo efetiva, devido a sua reduzida capacidade de geração de dados, que leva a necessidade de obtenção de produtos de PCR de até 600 pb para adequada leitura do sequenciamento. Além disto, condições específicas do gene MEN1, como a ausência de "hot spots" mutacionais, levam a necessidade de sequenciamento de toda sua extensão (9Kb) e contribuem para tornar esta técnica laboriosa e dispendiosa. A subdivisão do gene para sequenciamento Sanger pode ocultar informações, principalmente de regiões intrônicas, que podem ser importantes para o desenvolvimento da doença. Tais dificuldades impedem a incorporação do diagnóstico gênico de MEN1 na prática clínica. Desde 2005, estão disponíveis tecnologias denominadas NGS (New Generation Sequencing), que consistem em ferramentas para o sequenciamento genético com capacidade aumentada de geração de dados, tornando-as mais atrativas e de melhor custo benefício. O NGS confere ainda maior velocidade ao processo de obtenção de dados e detém a capacidade de realizar a leitura completa do gene, incluindo regiões promotoras e intrônicas. Por isto, torna a leitura mais ampla e informativa, sem desconsiderar aspectos qualitativos. Dentre várias opções de NGS disponíveis, plataformas leves são consideradas mais adequadas para aplicação clínica, destacando-se as plataformas Ion PGM e Illumina MiSeq. Uma forte tendência tem sido mostrada de migração do sequenciamento Sanger para o NGS, incluindo a aplicação da mesma em diagnóstico genético de doenças complexas e de câncer hereditário. Entretanto, não há estudos prévios envolvendo NGS em MEN1. Diante disto, surge o interesse de avaliar a qualidade desta técnica como método de diagnóstico genético em MEN1 em comparação ao sequenciamento Sanger. Os objetivos são: validação da técnica de NGS utilizando como parâmetro o sequenciamento Sanger; avaliação de aspectos qualitativos e relação custo-benefício do NGS. Para tal, serão analisados 50 casos-índices com MEN1. Em avaliação preliminar, utilizando Ion PGM, foram analisados 4 casos-índices com mutação germinativa previamente conhecida no gene MEN1. Foi obtida uma cobertura média de leitura > 100x, com 100% da região alvo (gene MEN1) com no mínimo 10 reads, permitindo a avaliação com acurácia de todas as mutações germinativas. Também, foi encontrada uma média de 37 SNPs por paciente. Entretanto, inúmeros in/dels foram gerados dificultando a análise dos resultados. Este grande número de in/dels é causado por uma limitação específica da plataforma Ion PGM. Diante disto, optou-se pelo uso da plataforma Illumina MiSeq pela análise dos dados gerados serem fornecidos na própria plataforma, não resultar na geração de falsos in/dels e devido a menor probabilidade de erros frente às sequencias ricas em C-G, comuns no gene MEN1. O enriquecimento da amostra será realizado por meio de "long range PCR" que amplificará toda a região genômica do gene MEN1. Esta reação foi padronizada durante o estudo preliminar com a plataforma Ion PGM e será aplicada com a plataforma Illumina MiSeq. Este projeto pretende, assim, introduzir esta técnica como ferramenta de diagnóstico gênico de MEN1 em nosso meio. (AU)