Reprogramação de fibroblastos de pele e células do cordão umbilical por meio de plasmídeos virais e transposons na produção de ips equinas.

Resumo

Nas últimas décadas, as pesquisas envolvendo a biologia das células-tronco tem abordado um amplo espectro de fenômenos, que vão desde o nível tecidual e celular, até o seu uso em terapias celulares. Esta crescente atenção sugere que precisamos rever conceitos básicos da organização das células-tronco, para compreendermos completamente os processos de diferenciação funcional. Desta forma, o instrumento da reprogramação celular através da manipulação gênica nos fornece subsídios para melhor compreender os processos de renovação e diferenciação que constituem as características fundamentais das células tronco. Embora a reprogramação celular por meio de plasmídeos virais tenha sido relatada com sucesso em diversas espécies animais, outras técnicas alternativas também podem ser empregadas, como o uso de transposons, ou seja, pedaços de DNAs que podem ser introduzidos nas células e efetuar a reprogramação, eliminando assim a partícula viral indesejada. As pesquisas envolvendo a produção de iPS de animais de grande porte ainda são escassas. Desta forma não se tem conhecimento de qual o melhor tipo celular a ser utilizado, e nem tão pouco de qual a metodologia de reprogramação mais eficiente. Sabe-se que o cordão umbilical possui uma reserva rica em células-tronco mesenquimais, as quais por serem multipotentes podem representar uma alternativa para melhorar a eficiência da obtenção de iPS em comparação ao uso de fibroblastos. As iPSs potencialmente podem ser utilizadas para terapia regenerativa, para o estudo de doenças e fármacos e também na melhoria dos resultados da clonagem terapêutica e animal, tendo um enorme potencial de utilização em diversas áreas do conhecimento incluindo a medicina equina. O objetivo deste projeto é obter iPS por meio de transfecção viral e não-viral de células do cordão umbilical e fibroblastos equinos, visando observar qual o tipo de tranfecção e qual o tipo de célula são mais eficientes para reprogramação celular. Para ambos os tipos celulares utilizaremos plasmídeos virais e transposons contendo os genes OCT-4, C-MYC, KLF-4 e SOX2 adicionados ao gene GFP para que as células transduzidas possam ser identificadas (GFP positivas); avaliaremos as alterações causadas no perfil de expressão gênica das células pelo método de PCR em tempo real; acompanharemos as modificações na morfologia das células equinas pós-transfecção; avaliaremos as células modificadas por imunocitoquímica com os marcadores típicos de células-tronco embrionárias (como os da família SSEA e TRA) e, por fim induziremos estas células a se diferenciar nos tecidos dos três folhetos germinativos. Esperamos que o uso de transposons e das células do cordão umbilical equino aumentem a eficiência de produção de iPS em relação ao método tradicional.