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Caracterização da morfologia de E. coli e da produção de proteína recombinante sob diferentes condições de indução

Processo: 13/20985-1
Modalidade de apoio:Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
Vigência (Início): 01 de dezembro de 2013
Vigência (Término): 30 de novembro de 2014
Área do conhecimento:Engenharias - Engenharia Química - Tecnologia Química
Pesquisador responsável:Teresa Cristina Zangirolami
Beneficiário:Jéssica Hilário Bonomo
Instituição Sede: Centro de Ciências Exatas e de Tecnologia (CCET). Universidade Federal de São Carlos (UFSCAR). São Carlos , SP, Brasil
Vinculado ao auxílio:08/05207-4 - Vacina conjugada anti-pneumocócica: estudos sobre a viabilidade de uma vacina polissacarídeo capsular - PSPA, AP.TEM
Assunto(s):Proteínas recombinantes   Diferenciação celular   Lactose   Caracterização   Microscópio óptico   MATLAB   Escherichia coli   Streptococcus pneumoniae
Palavra(s)-Chave do Pesquisador:Escherichia coli | Indução promotor Lac UV | Iptg | lactose | Produção de PspA recombinante | Engenharia de Bioprocessos

Resumo

Streptococcus pneumoniae é uma bactéria gram-positiva causadora de diversas doenças, entre elas pneumonia, infecções de ouvido médio e sinusites. A vacinação é a forma mais eficaz de prevenir infecções causadas por esta bactéria, sendo a vacina conjugada, na qual o polissacarídeo capsular (PS), principal fator de virulência da bactéria, é ligado covalentemente a uma proteína carreadora, a mais recomendada. A utilização de uma proteína antigênica da superfície da bactéria como proteína carreadora pode aumentar a capacidade de imunização da vacina, diminuindo a quantidade de PS necessário e, portanto, custos de produção. Por suas características antigênicas, a proteína PspA foi selecionada para a produção de uma nova vacina conjugada pneumocócica no projeto temático em desenvolvimento "Vacina conjugada antipneumocócica: estudos sobre a viabilidade de uma vacina polissacarídeo-proteína A de superfície de pneumococo" (08/05207-4), coordenado pela pesquisadora Dra. Martha Massako Tanizaki, do Centro de Biotecnologia do Instituto Butantan. Para a obtenção da proteína PspA, foi escolhida a bactéria gram-negativa Escherichia coli, amplamente usada para a produção de proteínas recombinantes devido à facilidade de manipulação genética e de obtenção de altas densidades celulares. Porém, a produção de uma proteína estranha à célula desencadeia respostas ao estresse que afetam a morfologia e o metabolismo, tais como o aparecimento de células alongadas durante a fase de indução, já relatado na literatura. Nos cultivos de alta densidade comumente usados para a produção de proteínas, a diferenciação celular pode contribuir para o aumento da viscosidade do caldo, afetando principalmente a transferência de oxigênio. Este estudo tem como objetivo avaliar a influência das condições de indução e do acúmulo da proteína de interesse sobre a célula, especialmente sobre sua morfologia. Os experimentos serão conduzidos em câmara incubadora, a 300 rpm, com duas linhagens de E. coli (BL21(DE3) e M15), transformadas com os plasmídeos pET37b+ e pQE30, respectivamente, para a expressão das proteínas PspA4Pro e PspA94-PdT. IPTG e lactose serão avaliados como indutores, sob condições moderada (27ºC) e acelerada (37ºC) de indução, em meios definido e complexo. Para a lactose, também serão avaliadas diferentes estratégias de indução: por pulso ou gradual (autoindução).Os experimentos serão acompanhados por medidas de concentração celular (densidade ótica e método da massa seca), retenção plasmidial (plaqueamento em meio sólido com e sem antibiótico e contagem de colônias), concentração da proteína (método de Bradford e densitometria de géis de eletroforese) e concentração de glicerol, glicose, lactose e ácidos orgânicos (CLAP). O acompanhamento da morfologia será feito pela observação de lâminas coradas pelo método de Gram em microscópio ótico equipado com câmera, seguida por aquisição de imagens digitais, que serão binarizadas (software ImageJ) e processadas em rotina desenvolvida em Matlab para estimativa do comprimento e diâmetro das células. Condições de cultivo que favoreçam a diferenciação celular e/ou a síntese de proteína serão selecionadas para obtenção de amostras de suspensão celular para posterior análise em microscópio eletrônico de varredura e caracterização mais detalhada. As condições de cultivo selecionadas serão ainda reproduzidas em cultivos em biorreator de bancada para estudos mais detalhados do perfil de acúmulo da proteína e sua influência na morfologia. Espera-se, com os estudos aqui propostos, integrar os conhecimentos relacionados às mudanças morfológicas e metabólicas observadas durante a produção de proteína heteróloga por E. coli e, com isso, modular a estratégia de indução em tempo real.(AU)

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