Investigação do papel de agonistas tendenciosos ("biased agonists") para o receptor AT1 na formação do complexo de sinalização ligante-receptor-Beta-arrestina-quinases

Resumo

Nos últimos anos foi descrito que alguns agonistas de receptores acoplados à proteína G (GPCRs) são capazes de promover um perfil de ativação preferencial, ou tendencioso, para uma determinada via de sinalização intracelular. Este fenômeno recebeu diferentes nomes na literatura, tais como eficácia colateral, eficácia pluridimensional, seletividade funcional ou agonismo tendencioso (biased agonism). De maneira geral, esta preferência de ativação tem sido melhor estudada com relação à sinalização canônica (via ativação da proteína G) e a sinalização não-canônica (via B-arrestinas), que ocorre após a formação e internalização de um complexo que inclui ligante, receptor, B-arrestina (uma proteína de suporte (scaffold)) e quinases. Várias drogas foram descobertas como agonistas tendenciosos (biased agonists) para uma das duas vias de sinalização. Apesar dos diversos estudos evidenciando a existência e relevância dos agonistas tendenciosos em diferentes sistemas de receptores, até o momento não existem na literatura estudos avaliando se um mesmo grupo de agonistas tendenciosos para uma mesma via (e.g. para a via de B-arrestinas) possam apresentar diferenças nas sinalizações após o recrutamento das B-arrestinas. Portanto, o objetivo deste projeto é investigar se a ativação do receptor AT1 pela AngII e diferentes agonistas tendenciosos levam à formação de diferentes complexos de sinalização. Após estímulo e internalização, serão avaliados a interação das B-arrestinas 1 e 2 com os complexos Raf-1/MEK1/ERK1/2, Ask1/MKK4/JNK3. Será realizado imunoprecipitação das B-arrestinas seguido de western blotting com anticorpos específicos para cada proteína das distintas vias de sinalização. Além disso, os perfis de ativação de ERK1/2 e JNK3 serão avaliados pela técnica de Alphascreen SureFire (TGR BioSciences / PerkinElmer) e a "tendência" de ativação das vias de sinalização (ERK1/2 ou JNK3) para cada condição será calculada pela determinação das razões das "eficiências de acoplamento" tau.