Caracterização bioquímica de novas variantes de ²-lactamases de espectro estendido (ESBL) identificadas em São Paulo, SP, Brasil

Resumo

A resistência bacteriana é um problema mundial de saúde pública, facilitado pela pressão seletiva do uso de antimicrobianos na clínica e em outras atividades. As ²-lactamases de espectro estendido (ESBL) são uma das formas mais prevalentes de resistência em Gram negativos no mundo, e devido à frequência das mutações pontuais ocorridas nessas enzimas, há uma grande facilidade de surgimento de novas variantes enzimáticas, podendo implicar em novos perfis de resistência aos antimicrobianos ²-lactâmicos. Justificativa: a descoberta de duas novas variantes de ESBL em cepas hospitalares de um recente estudo mostra que, além do problema mundial de disseminação de genes de resistência, a pressão seletiva de antimicrobianos exercida sobre as bactérias pode possibilitar o surgimento de enzimas com atividade hidrolítica mais ampla. Portanto, as propriedades bioquímicas das novas variantes enzimáticas necessitam ser devidamente caracterizadas. Objetivo: caracterizar bioquimicamente as novas variantes de ESBL TEM-197 e CTX-M-131. Material e Métodos: os genes codificadores das novas enzimas, identificados em um estudo prévio, serão clonados em um sistema de expressão, e os clones serão submetidos à medida da concentração inibitória mínima por meio de Etest, extração de enzimas por congelamento (-20ºC) e descongelamento (20ºC), e purificação das mesmas em coluna de troca iônica conectada a um purificador. As frações ativas da enzima serão detectadas por sistema iodométrico, e o grau de purificação das amostras será verificado por SDS-PAGE. O ponto isoelétrico das enzimas será determinado por eletroforese bidimensional em gel de poliacrilamida, a atividade hidrolítica por espectrofotometria utilizando nitrocefin como substrato, e a massa molecular será determinada por HPLC com espectrometria de massa. Os parâmetros cinéticos - constantes Km e kcat, bem como a relação kcat/Km (eficiência catalítica), serão medidos para cada composto b-lactâmico, pela variação de absorbância em espectrofotômetro. Resultados Esperados. Espera-se que a caracterização bioquímica das novas enzimas forneça informações técnicas e epidemiológicas relevantes para a comunidade científica, e que as técnicas utilizadas neste projeto possam ser implantadas futuramente no Brasil. (AU)