Estudo cinético e bioquímico da interação física direta entre eIF5A e o ribossomo de Saccharomyces cerevisiae e de humano

Resumo

O fator de início de tradução 5A (eIF5A) é altamente conservado em arqueas e eucariotos e essencial para a viabilidade celular. Trata-se da única proteína conhecida que contém o aminoácido hipusina, essencial para a função de eIF5A e gerado por uma modificação pós-traducional. Após ter sido amplamente envolvido em diversos processos celulares, apenas mais recentemente foi melhor definido um papel para eIF5A no processo de síntese proteica, mais especificamente durante a etapa de elongação da tradução. Para melhorar o entendimento e a descrição do mecanismo de eIF5A na tradução, é necessário determinar como ocorre a ligação entre eIF5A e o ribossomo e em que tipo de complexo ribossomal eIF5A se liga. Resultados recentes não publicados de nosso laboratório, apresentados na tese de doutorado da proponente deste projeto, revelaram ligação direta de eIF5A apenas na subunidade maior do ribossomo, sendo a hipusinação requerida para esta interação. Para tanto, é proposta para este projeto a continuação dos ensaios cinéticos e bioquímicos utilizando técnicas atuais para responder aos objetivos: 1) determinação dos tipos de complexo ribossomal aos quais eIF5A se liga, bem como busca de componentes competidores ou auxiliadores na ligação de eIF5A com o ribossomo utilizando ensaios de anisotropia de fluorescência; 2) mapeamento dos pontos de interação direta entre eIF5A e o ribossomo por clivagem de rRNA e análise por primer extension; 3) identificação de proteínas e rRNA que interagem fisicamente com eIF5A através de indução de crosslinking in vitro. Os resultados desses objetivos irão revelar como e onde eIF5A se liga no ribossomo e melhorar de maneira significativa a descrição do papel de eIF5A na tradução.