Avaliação de inflamassomo NLRP3 e autofagia em placentas de gestantes portadoras de pré-eclâmpsia

Resumo

A pré-eclâmpsia (PE) é uma síndrome específica da gestação, caracterizada por hipertensão arterial e proteinúria que se manifestam a partir da 20a semana de gestação. O desenvolvimento dessa doença é decorrente de má-adaptação imunológica na interface materno-fetal, determinando baixo fluxo sanguíneo uteroplacentário que resulta em hipóxia/isquemia placentária, estresse oxidativo e restrição de crescimento fetal. O estresse oxidativo, resultante de lesão causada por hipóxia e reperfusão placentários, induz uma resposta inflamatória com produção elevada de mediadores de disfunção da célula endotelial, como citocinas pró-inflamatórias e mediadores lipídicos. Essa resposta inflamatória se torna sistêmica e exacerbada, afetando o estado funcional das células da imunidade inata. Produtos endógenos, denominados "sinais de perigo" ou padrões moleculares associados a danos (DAMPs) podem ser liberados durante lesão tecidual, decorrente de inflamação estéril. Estes produtos são representados por moléculas como reativos intermediários do oxigênio (ROS), proteínas liberadas de células mortas e produtos liberados da matriz extracelular, que interagem com receptores de reconhecimento de padrão (PRR) denominados NOD-like ou NLR. Esses receptores são constituídos por proteínas citosólicas que reconhecem os produtos endógenos e recrutam outras proteínas, formando complexos de sinalização que promovem a inflamação. Esses complexos são chamados inflamassomos e sua principal função é gerar a produção de IL-1b, responsável pela resposta inflamatória intensa. Autofagia é uma via de degradação lisossomal que remove agregados proteicos e organelas danificadas mantendo a integridade celular, que pode estar comprometida em gestantes portadoras de PE, devido à presença de lesões placentárias causadas por hipóxia/isquemia. Considerando que a geração de inflamassomo está relacionada com resposta inflamatória intensa e que a autofagia pode modular o processo inflamatório, contribuindo para a manutenção da homeostase intracelular, o presente projeto tem como objetivo determinar a presença de inflamassomo NLRP3 e a ocorrência de autofagia em placenta de gestantes portadoras de PE. Serão estudadas 40 gestantes, sendo 20 normotensas e 20 portadoras de pré-eclâmpsia. Fragmentos de placenta, abrangendo as faces materna e fetal serão obtidos imediatamente após o parto. Cada fragmento será recortado em quatro partes iguais, sendo uma delas colocada em formol tamponado para análise imunoistoquímica; outra parte será congelada em nitrogênio liquido para posterior preparo de homogenato e análise por Western Blot e ensaio imunoenzimático (ELISA). A terceira parte será empregada para técnica de reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (RT-qPCR) e o quarto fragmento será fixado em glutaraldeido 2,5% para avaliar a presença de autofagia por microscopia eletrônica de transmissão. A ocorrência de autofagia será determinada, também, pela quantificação direta das proteínas LC3, Beclin-1 e mTOR por Western Blot, imunoistoquímica ou indireta por meio quantificação de RNAm pela técnica de RT-qPCR. Para determinação do inflamassomo serão avaliadas a expressão gênica de NLRP3, caspase-1, IL-1², IL-18 e TNF-± por RT-qPCR e, a concentração proteica de caspase 1 e das citocinas IL-1 ², IL-18, TNF-± e HMGB-1 será avaliada por Western Blot e ELISA. A expressão de NLRP3, caspase 1, IL-1 ², IL-18, TNF-± e HMGB-1 será ainda, determinada por imunoistoquímica nos cortes placentários.