Uso de técnicas de silenciamento de genes para avaliação do papel da periostina durante a morfogênese do ducto de Wolff

Resumo

Introdução: O grupo de pesquisa do laboratório do Dr. Hinton tem investigado os mecanismos moleculares envolvidos no controle da morfogênese do ducto de Wolff (DW)/epidídimo, o qual é essencial para a manutenção da fertilidade masculina. Recentemente, este grupo tem demonstrado a presença de periostina na matriz extracelular (MEC) que envolve o DW e tem sugerido que esta proteína regule o alongamento e dobramento do DW. Proposição: Neste estudo, será proposto: 1-) obter experiência prática quanto à dissecação de DW de embriões de camundongos, bem como aprender a manter este ducto em meio de cultura; 2-) silenciar a expressão da periostina usando diferentes métodos (oligonucleotídeos morfolinos, siRNA e shRNA) e examinar a efetividade de cada método; e 3-) examinar o alongamento e dobramento do DW/epidídimo após o silenciamento da periostina. Métodos: O DW será removido dos embriões, mantidos em cultura e o silenciamento da periostina será realizada por meio do uso de morfolinos, plasmídios de shRNA e siRNA. Os níveis de mRNA serão quantificados pelo PCR em tempo real. As dobras do DW em desenvolvimento serão avaliadas quantitativamente após o silenciamento e comparadas com os controles. A localização e expressão de periostina, bem como a atividade mitótica das células do ducto, serão avaliadas por imunofluorescência. Resultados esperados: Espera-se que, pelo menos, um dos métodos de silenciamento por RNAi cause redução de, ao menos, 90% da expressão dos níveis de periostina. Nos DW silenciados, espera-se também uma redução no número de dobras, sugerindo a participação da periostina na flexibilidade da MEC e, portanto, permitindo o alongamento necessário do DW durante seu desenvolvimento. Com este modelo de estudo, o qual pretendo inserir futuramente em nosso laboratório, será possível dar continuidade a novas pesquisas em colaboração com o Dr. Hinton e, assim, atrair estudantes e demais pesquisadores para a formação de um grupo de pesquisa nesta área, consolidando este novo modelo e enriquecendo a minha linha de pesquisa no meu Departamento. (AU)