Análise comparativa do perfil molecular do status mutacional dos genes BRAF, NRAS e C-Kit em melanomas esporádicos primários e metastáticos

Resumo

A ativação anormal da MAPK, via que normalmente regula a proliferação, diferenciação e crescimento celular está presente em mais de 80% dos melanomas primários, e em mutações em algumas proteínas ao longo da via RAS-RAF-MEK-ERK. Estas mutações têm sido documentadas em todos os subtipos de melanoma, incluindo os cutâneos, nos quais as mutações em BRAF e NRAS são mais comuns. Observou-se que BRAF estava mutado em 50% a 70% dos pacientes com melanoma. A mutação mais comum em BRAF, V600E, introduz uma alteração conformacional que acarreta a troca de uma valina por um ácido glutâmico, lisina, arginina ou ácido aspártico na ativação do domínio de BRAF. Em geral, mutações em Ras não ocorrem com grande frequência em melanomas como acontecem em outras neoplasias; em melanoma a mutação mais frequentemente é em NRAS (15 a 30%), geralmente, através da substituição de uma glutamina por uma leucina na posição 61 (Gln61Leu). O oncogene NRAS apresenta uma proporção de mutação de 56% em nevos congênitos, 33% em melanomas primários e 26% em melanomas metastáticos. Mutações em C-KIT demonstraram iniciar uma série de eventos de sinalização que resultam em proliferação celular e propagação da neoplasia. Vários estudos revelaram que a expressão do receptor de tirosina quinase codificada pelo proto-oncogene C-Kit diminui gradualmente durante o crescimento e invasão do melanoma humano. Objetivos: identificar mutações dos genes BRAF e NRAS através de técnica de pirosequenciamento e de C-Kit através de técnica de sequenciamento direto e quantificação da expressão de proteína do mesmo em melanomas cutâneos esporádicos primários e metastáticos. Através da identificação das mutações pretende-se: Estabelecer a relação da incidência da mutação de BRAF, NRAS e C-Kit em melanomas cutâneos primários e metastáticos e ainda estabelecer relações entre as mutações encontradas e a progressão tumoral no melanoma cutâneo. Materiais e métodos: O DNA será extraído a partir de tecido parafinado por meio de técnica de macrodissecção, quando não for possível será feita microdissecção a laser ou pesquisa em banco de macromoléculas. O DNA extraído será avaliado para presença de mutação nos genes BRAF e NRAS através de técnica de pirosequenciamento e C-Kit, através de sequenciamento direto. Serão utilizados primers adquiridos comercialmente para PCR e pirosequenciamento de BRAF e NRAS; e primers para PCR e sequenciamento de C-Kit, desenvolvidos na própria instituição. Para C-Kit também será realizada imunoistoquímica em sistema automatizado. Resultados esperados: identificar perfis diferenciados da expressão dos genes BRAF e NRAS e da expressão de proteínas e do gene C-kit na neoplasia primária e em suas respectivas metástases, e desta forma, se possível, estabelecer relação entre estas e a progressão do melanoma cutâneo. (AU)