Associações entre a evolução molecular dos genes HOX e a evolução da diversidade morfológica em Squamata e Marsupialia

Resumo

Em Squamata, morfologias ápodes surgiram independentemente diversas vezes a partir de linhagens ancestrais que apresentavam autopódio. A recorrência das transições entre essas duas morfologias, aliada às evidências de reversão na perda de dígitos em linhagens específicas, torna Squamata um grupo particularmente interessante para a investigação de associações entre evolução morfológica do autopódio e variações no padrão de expressão de genes durante o desenvolvimento embrionário. Dentre esses genes, podemos citar o grupo Hox, composto por fatores de transcrição que regulam a expressão de diversos outros genes e organizam temporal e espacialmente a formação de diversas estruturas nos vertebrados. Alguns desses genes são expressos durante o posicionamento das patas e a formação de elementos do autopódio em tetrápodes, e variações em sua expressão parecem associadas à evolução de novos fenótipos, incluindo o surgimento da forma alongada e ápode que caracteriza as serpentes. Tais variações podem envolver mutações específicas tanto nas sequências nucleotídicas codificantes desses genes, alterando seu papel na cascata de sinalização durante a formação do autopódio, quanto mutações em suas regiões regulatórias, o que afetaria interações cis-trans envolvidas na ativação da expressão desses genes. Um gene em particular, denominado Hoxd-11, é expresso durante a formação do autopódio em embriões de tetrápodes, e sua expressão, controlada pela região regulatória CsB, difere entre morfologias pentadáctilas e aquelas com quatro dígitos ou menos. O presente projeto de doutorado investiga possíveis alterações sediadas na via de sinalização que envolve Hoxd-11 que podem ter ocorrido durante a evolução de morfologias ápodes em Squamata, comparando especificamente padrões detectados nas regiões regulatórias e codificantes desse gene entre duas linhagens distintas nas quais essa morfologia se originou: anfisbenas e serpentes. Testes funcionais complementarão a interpretação dos padrões moleculares detectados em Hoxd-11, e os resultados serão interpretados no contexto da evolução paralela da morfologia ápode nessas duas linhagens de Squamata. O estudo comparativo de regiões codificantes (exon-1) e regulatórias (CsB) do gene Hoxd-11 será implementado a partir do sequenciamento dessas regiões em representantes de anfisbenas e serpentes, utilizando-se jacarés como grupo externo. A partir dos padrões eventualmente identificados, duas abordagens alternativas são propostas para testar a significância funcional de diferenças nas sequências de nucleotídeos. Se forem detectados padrões na região regulatória CsB relacionados com a origem de morfologias ápodes, testes realizados a partir da técnica de pull down permitirão verificar diferenças na ligação de fatores de transcrição com afinidade pelas sequências nucleotídicas de CsB. Os testes serão implementados utilizando-se o CsB de uma espécie de anfisbena, uma de serpente e o grupo externo, e os pull downs serão realizados com células de brotos do membro de embriões de galinha em diferentes estágios de desenvolvimento. Em contrapartida, se forem identificados padrões evolutivos na sequencia de nucleotídeos do exon-1 de Hoxd-11 relacionados com a origem de morfologias ápodes em serpentes e anfisbenas, o significado funcional desses padrões será testado por análises de transcriptomas a partir de células de camundongo desprovidas da expressão endógena desse gene (controle negativo), contrastadas com transcriptomas dessas células transfectadas com plasmídeos de expressão contendo: I) Hoxd-11 de uma espécie de serpente; II) Hoxd-11 de uma espécie de anfisbena; e III) Hoxd-11 de camundongo (controle positivo). A investigação dos padrões de evolução molecular de regiões codificantes e regulatórias de Hoxd-11 aliada a testes funcionais contribuirá para a compreensão dos possíveis mecanismos de evolução da diversidade morfológica em vertebrados que resultam na origem de morfologias ápodes em clados distintos. (AU)